Zellaussaat-Rechner
Wählen Sie Platte, Schale oder Flasche, legen Sie die gewünschte Dichte in Zellen/cm² oder Zellen pro Well fest und geben Sie die Konzentration Ihrer Zellsuspension ein. Der Rechner liefert das Volumen von Suspension und frischem Medium für den gesamten Aussaatmix, die Menge je Well und die Gesamtzahl der benötigten Zellen. Läuft vollständig in Ihrem Browser. Kostenlos, ohne Anmeldung.
Verwenden Sie die Angabe Ihres Herstellers, wenn sie von der Tabelle abweicht.
Aus Ihrer Zellzählung, zum Beispiel mit einem Hämozytometer.
Zellen plus Medium nach der Aussaat.
Gleicht Pipettierverluste aus; 10 % sind üblich.
Ergebnisse
0,5016
Zu entnehmende Zellsuspension (mL)
12,7
Frisch zuzugebendes Medium (mL)
38.000
Zellen je Well oder Gefäß
38
Suspension je Well oder Gefäß (µL)
501.600
Insgesamt benötigte Zellen
20.000
Erreichte Dichte (Zellen/cm²)
Aussaatmix
| Bestandteil | Volumen (mL) |
|---|---|
| Zellsuspension | 0,5016 |
| Frisches Medium | 12,7 |
| Gesamter Aussaatmix | 13,2 |
Vorsichtig mischen und dann 1 mL in jeden der 12 Wells oder Gefäße geben.
Die Rechnung
Zellen je Gefäß = 20.000 Zellen/cm² × 1,9 cm² = 38.000
Suspension = benötigte Zellen ÷ Konzentration = 501.600 ÷ 1 × 10⁶ = 0,5016 mL
So verwenden Sie den Zellaussaat-Rechner
- 1. Wählen Sie das Gefäß. Die Wachstumsfläche stammt aus der Tabelle des Rechners. Weicht die Fläche Ihrer Platte ab, tragen Sie sie in das Feld für die Überschreibung ein.
- 2. Legen Sie die Dichte fest. Geben Sie Zellen pro cm² ein (nützlich, wenn Sie zwischen Formaten wechseln) oder Zellen pro Well, wie es in vielen Protokollen angegeben ist. Die Schaltfläche neben dem Gefäß setzt die Startzahl von Thermo Fisher ein.
- 3. Geben Sie die Suspension ein. Verwenden Sie die Konzentration aus Ihrer Zählung und das Gesamtvolumen, das Sie nach der Aussaat in jedem Well wünschen. Zusätzlichen Mix addieren Sie, um Pipettierverluste zu decken.
- 4. Stellen Sie den Aussaatmix her. Mischen Sie die angezeigten Volumina von Suspension und frischem Medium, mischen Sie vorsichtig und geben Sie in jeden Well die gleiche Menge.
Die Rechnung
Zellen je Well
Zellen je Well = Dichte (Zellen/cm²) × Wachstumsfläche (cm²)
Suspension
Volumen der Suspension (mL) = benötigte Zellen ÷ Zellen/mL in der Suspension
Medium
Frisches Medium = Volumen des Aussaatmixes − Suspension
Der Aussaatmix wird für alle Wells in einem Röhrchen hergestellt, und zwar für N × (1 + Zuschlag) Wells, damit der letzte Well nicht zu knapp wird. Die Suspension macht dabei nur einen kleinen Teil aus. Ein gemeinsamer Mix, der dann verteilt wird, geht schneller als das Zugeben von Zellen in jeden Well einzeln, und die Wells werden deutlich gleichmäßiger. Zählen Sie die Suspension zuerst (ein Hämozytometer-Zellzählrechner rechnet Quadratzählungen in Zellen/mL um) und resuspendieren Sie vor jedem Schritt gründlich, denn Zellen sinken rasch ab.
Wachstumsflächen und Startzahlen
Die Gefäßtabelle des Rechners stammt aus Useful Numbers for Cell Culture von Thermo Fisher Scientific (Gibco Cell Culture Basics). Dort wurden die Startzahlen mit HeLa-Zellen gemessen. Repräsentative Werte:
| Gefäß | Wachstumsfläche (cm²) | Startzahl | Wachstumsmedium (mL) |
|---|---|---|---|
| 6-Well-Platte | 9,6 | 0,3 × 10⁶ je Well | 1–3 |
| 12-Well-Platte | 3,5 | 0,1 × 10⁶ je Well | 1–2 |
| 24-Well-Platte | 1,9 | 0,05 × 10⁶ je Well | 0,5–1,0 |
| 96-Well-Platte | 0,32 | 0,01 × 10⁶ je Well | 0,1–0,2 |
| 100-mm-Schale | 56,7 | 2,2 × 10⁶ | 12 |
| T-75-Flasche | 75 | 2,1 × 10⁶ | 8–15 |
Betrachten Sie die Startzahlen als Ausgangspunkt, nicht als Regel. Die richtige Dichte hängt vom Zelltyp, der Dauer des Experiments und der Teilungsrate ab. Auch die Wachstumsflächen unterscheiden sich zwischen Herstellern etwas. Prüfen Sie deshalb das Produktdatenblatt und überschreiben Sie die Fläche, wenn Ihr Gefäß eine andere Angabe hat. Die Empfehlung von Corning, 0,2–0,3 mL Medium je cm² zu verwenden, ist ein nützlicher Gegencheck für Flaschen und Schalen. Sie gilt jedoch nicht für die kleinen Wells von Mikrotiterplatten, wo der Meniskus das Verhältnis verändert.
Beispiel: zwölf Wells einer 24-Well-Platte
Sie wollen 20.000 Zellen/cm² in zwölf Wells einer 24-Well-Platte, jeweils auf 1 mL aufgefüllt, aus einer Suspension mit 1 × 10⁶ Zellen/mL, mit 10 % zusätzlichem Mix (die Standardwerte des Rechners).
- Zellen je Well: 20.000 × 1,9 = 38.000, das sind 38 µL Suspension je Well.
- Mix für 12 × 1,1 = 13,2 Wells: insgesamt 13,2 mL mit 38.000 × 13,2 = 501.600 Zellen.
- Suspension: 501.600 ÷ 1.000.000 = 0,5016 mL. Frisches Medium: 13,2 − 0,5016 = 12,7 mL.
- Geben Sie 1 mL des Mixes in jeden Well.
Wenn die Suspension zu verdünnt ist
Wenn Ihre Zellen 10.000 Zellen/mL enthalten, braucht man für 38.000 Zellen in einem Well 3,8 mL Suspension, mehr als die 1 mL, die in den Well passen. Der Rechner weist darauf hin, statt eine negative Menge Medium auszugeben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei moderater Geschwindigkeit ab (der Zentrifugen-Rechner: U/min zu RCF rechnet die × g eines Protokolls in die U/min für Ihren Rotor um), verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie in einem kleineren Volumen und zählen Sie erneut, bevor Sie aussäen.
Häufige Fehler
- Tote Zellen mitzählen. Säen Sie mit der Zahl lebender Zellen aus und verwenden Sie die Vitalität aus der Trypanblau-Zählung.
- Einheiten vermischen. Zellen pro cm² und Zellen pro Well unterscheiden sich in einer 24-Well-Platte um den Faktor 1,9. Prüfen Sie, was das Protokoll meint.
- Nicht erneut mischen. Zellen sinken innerhalb von Minuten ab. Eine Pipette aus einem nicht gemischten Röhrchen von oben enthält daher zu wenige Zellen.
- Randwells besäen. Verdunstung in den äußeren Wells einer Platte verändert die Konzentrationen. Viele Labore füllen sie deshalb mit Puffer oder Medium und lassen sie unbesät.
- Passage und Zelltyp vergessen. Eine Dichte, die zu schnell wachsenden HeLa-Zellen passt, lässt langsamere oder kontaktgehemmte Linien überwachsen.
Häufig gestellte Fragen
- Wie berechnet man, wie viele Zellen pro Well ausgesät werden?
- Multiplizieren Sie die Zieldichte in Zellen/cm² mit der Wachstumsfläche des Wells in cm². Ein Well einer 24-Well-Platte hat etwa 1,9 cm². Bei 20.000 Zellen/cm² sind das 38.000 Zellen je Well. Gibt Ihr Protokoll direkt Zellen pro Well an, geben Sie diesen Wert ein.
- Wie berechnet man das Volumen der Zellsuspension, das man zugibt?
- Teilen Sie die benötigte Zellzahl durch die Zellen pro Milliliter in Ihrer Suspension. 38.000 Zellen aus einer Suspension mit 1 × 10⁶ Zellen/mL ergeben 0,038 mL, also 38 µL. Bei vielen Wells stellen Sie einen gemeinsamen Aussaatmix her und teilen ihn auf.
- Wie viele Zellen sollte man in einer 24-Well-Platte aussäen?
- Die Tabelle von Thermo Fisher nennt etwa 50.000 Zellen je Well für HeLa-Zellen, das entspricht rund 26.000 Zellen/cm². Die richtige Zahl hängt von der Zelllinie und der Dauer des Experiments ab. Verwenden Sie weniger Zellen für eine längere Kultur oder schnell wachsende Zellen, und mehr, wenn die Zellen am nächsten Tag konfluent sein sollen.
- Wie viele Zellen sind in einer konfluenten T-75-Flasche?
- Thermo Fisher nennt etwa 8,4 × 10⁶ HeLa-Zellen bei Konfluenz in einer T-75-Flasche (75 cm²), also grob 112.000 Zellen/cm². Das variiert stark mit Zelltyp und Zellgröße. Verwenden Sie die Angabe nur als groben Anhaltspunkt.
- Warum sollte man dem Aussaatmix einen Überschuss zugeben?
- Flüssigkeit bleibt an den Wänden des Röhrchens und an der Pipettenspitze hängen. Ein Mix, der genau für N Wells angesetzt ist, lässt daher den letzten Well zu knapp. Üblich sind 10 % Überschuss. Bei nur wenigen Wells setzen Sie den Mix besser für einen zusätzlichen Well an.
- Verändert das Medium-Volumen die Zellzahl?
- Nein. Die Zellzahl je Well wird durch Dichte und Fläche bestimmt. Das Volumen, in dem Sie aussäen, verändert nur, wie stark die Zellen verdünnt sind, und wie viel davon die Suspension einnimmt.