Calculateur d'ensemencement cellulaire
Choisissez la plaque, la boîte ou le flacon, réglez la densité souhaitée en cellules par cm² ou en cellules par puits, et saisissez la concentration de votre suspension cellulaire. Le calculateur donne le volume de suspension et de milieu frais pour l'ensemble du mélange d'ensemencement, la quantité à mettre dans chaque puits et le nombre total de cellules nécessaire. Fonctionne entièrement dans votre navigateur. Gratuit, sans inscription.
Utilisez le chiffre de votre fabricant de récipients s'il diffère de celui du tableau.
Issue de votre comptage, par exemple à l'hémocytomètre.
Cellules et milieu une fois ensemencées.
Compense les pertes de pipetage ; 10 % est courant.
Résultats
0,5016
Suspension cellulaire à prélever (mL)
12,7
Milieu frais à ajouter (mL)
38 000
Cellules par puits ou récipient
38
Suspension par puits ou récipient (µL)
501 600
Nombre total de cellules nécessaires
20 000
Densité atteinte (cellules/cm²)
Mélange d'ensemencement
| Composant | Volume (mL) |
|---|---|
| Suspension cellulaire | 0,5016 |
| Milieu frais | 12,7 |
| Mélange d'ensemencement total | 13,2 |
Mélangez doucement, puis distribuez 1 mL dans chacun des 12 puits ou récipients.
Le calcul
cellules par récipient = 20 000 cellules/cm² × 1,9 cm² = 38 000
suspension = cellules nécessaires ÷ concentration = 501 600 ÷ 1 × 10⁶ = 0,5016 mL
Comment utiliser le calculateur d'ensemencement cellulaire
- 1. Choisissez le récipient. La surface de culture provient du tableau du calculateur. Si la surface de votre plaque diffère, saisissez-la dans la case de remplacement.
- 2. Réglez la densité. Saisissez des cellules par cm² (pratique lorsque vous passez d'un format à un autre) ou des cellules par puits, la forme la plus utilisée dans les protocoles. Le bouton à côté du récipient remplit le nombre de départ de Thermo Fisher.
- 3. Saisissez la suspension. Utilisez la concentration issue de votre comptage, et le volume total souhaité dans chaque puits une fois les cellules ajoutées. Ajoutez un surplus de mélange pour compenser les pertes de pipetage.
- 4. Préparez le mélange d'ensemencement. Combinez les volumes indiqués pour la suspension et le milieu frais, mélangez doucement et distribuez la même quantité dans chaque puits.
Le calcul
Cellules par puits
cellules par puits = densité (cellules/cm²) × surface de culture (cm²)
Suspension
volume de suspension (mL) = nombre total de cellules nécessaires ÷ cellules/mL de la suspension
Milieu
milieu frais = volume du mélange d'ensemencement − suspension
Le mélange d'ensemencement se prépare dans un seul tube pour tous les puits, pour N × (1 + surplus) puits afin que le dernier ne manque pas, et la suspension n'en constitue qu'une petite part. Préparer un seul mélange et le distribuer, plutôt qu'ajouter les cellules puits par puits, est plus rapide et donne des puits beaucoup plus homogènes. Comptez d'abord la suspension (un calculateur de comptage cellulaire à l'hémocytomètre convertit les comptages des carrés en cellules/mL), et remettez-la en suspension avec soin avant chaque étape, car les cellules sédimentent rapidement.
Surfaces de culture et nombres de départ
La table des récipients du calculateur provient de Useful Numbers for Cell Culture (Gibco Cell Culture Basics) de Thermo Fisher Scientific, où les nombres de départ ont été mesurés avec des cellules HeLa. Valeurs représentatives :
| Récipient | Surface de culture (cm²) | Nombre de départ | Milieu de culture (mL) |
|---|---|---|---|
| Plaque 6 puits | 9,6 | 0,3 × 10⁶ par puits | 1–3 |
| Plaque 12 puits | 3,5 | 0,1 × 10⁶ par puits | 1–2 |
| Plaque 24 puits | 1,9 | 0,05 × 10⁶ par puits | 0,5–1,0 |
| Plaque 96 puits | 0,32 | 0,01 × 10⁶ par puits | 0,1–0,2 |
| Boîte de 100 mm | 56,7 | 2,2 × 10⁶ | 12 |
| Flacon T-75 | 75 | 2,1 × 10⁶ | 8–15 |
Considérez les nombres de départ comme un point de départ, et non comme une règle : la bonne densité dépend du type cellulaire, de la durée de l'expérience et de la vitesse de division des cellules. Les surfaces de culture diffèrent aussi légèrement d'un fabricant à l'autre : vérifiez la fiche produit et remplacez la surface lorsque celle de votre récipient est différente. La recommandation de Corning, 0,2 à 0,3 mL de milieu par cm², est une vérification utile pour les flacons et les boîtes, mais elle ne s'applique pas aux petits puits des microplaques, où le ménisque modifie le rapport.
Exemple détaillé : douze puits d'une plaque 24 puits
Vous voulez 20 000 cellules/cm² dans douze puits d'une plaque 24 puits, chacun rempli à 1 mL, à partir d'une suspension à 1 × 10⁶ cellules/mL, avec 10 % de mélange en surplus (valeurs par défaut du calculateur).
- Cellules par puits : 20 000 × 1,9 = 38 000, soit 38 µL de suspension par puits.
- Mélange pour 12 × 1,1 = 13,2 puits : 13,2 mL au total, contenant 38 000 × 13,2 = 501 600 cellules.
- Suspension : 501 600 ÷ 1 000 000 = 0,5016 mL. Milieu frais : 13,2 − 0,5016 = 12,7 mL.
- Distribuez 1 mL du mélange dans chaque puits.
Lorsque la suspension est trop diluée
Si vos cellules sont à 10 000 cellules/mL, en mettre 38 000 dans un puits nécessite 3,8 mL de suspension, soit plus que le 1 mL que contient le puits. Le calculateur signale ce cas au lieu d'afficher une quantité de milieu négative. Centrifugez les cellules à faible vitesse (le calculateur tr/min en RCF pour centrifugeuse convertit les × g d'un protocole en tr/min pour votre rotor), éliminez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un volume plus petit, puis recomptez-les avant d'ensemencer.
Erreurs courantes
- Compter les cellules mortes. Ensemencez sur le comptage des cellules vivantes, et utilisez la viabilité issue du comptage au bleu trypan.
- Mélanger les unités. Les cellules par cm² et les cellules par puits diffèrent d'un facteur 1,9 dans une plaque 24 puits. Vérifiez ce que le protocole entend.
- Ne pas remélanger. Les cellules sédimentent en quelques minutes ; une pipette prélevée en haut d'un tube non remélangé est donc pauvre en cellules.
- Ensemencer les puits de bord. L'évaporation dans les puits externes d'une plaque modifie les concentrations ; beaucoup de laboratoires les remplissent de tampon ou de milieu et ne les ensemencent pas.
- Oublier le passage et le type cellulaire. Une densité adaptée aux cellules HeLa, à croissance rapide, provoquera un surpeuplement des lignées plus lentes ou à inhibition de contact.
Questions fréquentes
- Comment calculer le nombre de cellules à ensemencer par puits ?
- Multipliez la densité cible en cellules/cm² par la surface du puits en cm². Un puits de plaque 24 puits a environ 1,9 cm², donc 20 000 cellules/cm² correspondent à 38 000 cellules par puits. Si votre protocole donne directement des cellules par puits, saisissez-les.
- Comment calculer le volume de suspension cellulaire à ajouter ?
- Divisez le nombre de cellules nécessaires par le nombre de cellules par millilitre de votre suspension. 38 000 cellules à partir d'une suspension à 1 × 10⁶ cellules/mL représentent 0,038 mL, soit 38 µL. Pour de nombreux puits, préparez un seul mélange d'ensemencement et répartissez-le.
- Combien de cellules ensemencer dans une plaque 24 puits ?
- La table de Thermo Fisher suggère environ 50 000 cellules par puits pour les cellules HeLa, soit environ 26 000 cellules/cm². Le bon nombre dépend de la lignée cellulaire et de la durée de la culture : utilisez moins de cellules pour une culture plus longue ou pour des cellules à croissance rapide, et davantage si les cellules doivent être confluentes le lendemain.
- Combien de cellules y a-t-il dans un flacon T-75 confluent ?
- Thermo Fisher indique environ 8,4 × 10⁶ cellules HeLa à confluence dans un flacon T-75 (75 cm²), soit environ 112 000 cellules/cm². Cela varie beaucoup selon le type et la taille cellulaires : ne l'utilisez que comme ordre de grandeur.
- Pourquoi ajouter un surplus au mélange d'ensemencement ?
- Du liquide reste sur les parois du tube et dans l'embout de la pipette ; un mélange préparé exactement pour N puits laisse donc le dernier puits en manque. Un surplus de 10 % est courant ; avec peu de puits, préparez le mélange pour un puits de plus.
- Le volume de milieu modifie-t-il le nombre de cellules ?
- Non. Le nombre de cellules par puits est fixé par la densité et la surface. Le volume dans lequel vous ensemencez ne fait que modifier la dilution des cellules et la part de ce volume occupée par la suspension.