Calculadora de semeadura celular

Resultados

Como usar a calculadora de semeadura celular

1. 1. Escolha o recipiente. A área de crescimento vem da tabela da calculadora. Se a área da sua placa for diferente, digite-a na caixa de substituição.
2. 2. Defina a densidade. Informe células por cm² (útil quando você troca de formato) ou células por poço, que é a forma como muitos protocolos são escritos. O botão ao lado do recipiente preenche o número inicial da Thermo Fisher.
3. 3. Informe a suspensão. Use a concentração da sua contagem e o volume total que você quer em cada poço depois que as células forem adicionadas. Acrescente mistura extra para cobrir as perdas de pipetagem.
4. 4. Prepare a mistura de semeadura. Combine os volumes indicados para a suspensão e para o meio fresco, misture delicadamente e distribua a mesma quantidade em cada poço.

A aritmética

A mistura de semeadura é preparada em um único tubo para todos os poços, para N × (1 + extra) poços, de modo que o último não fique com menos; a suspensão ocupa apenas uma pequena parte dela. Preparar uma mistura única e distribuí-la, em vez de adicionar células poço a poço, é mais rápido e produz poços muito mais uniformes. Conte a suspensão primeiro (uma Calculadora de contagem de células em hemocitômetro converte as contagens dos quadrados em células/mL) e ressuspenda bem antes de cada etapa, porque as células sedimentam rapidamente.

Áreas de crescimento e números iniciais

A tabela de recipientes da calculadora é tirada de Useful Numbers for Cell Culture (Gibco Cell Culture Basics), da Thermo Fisher Scientific, onde os números iniciais foram medidos com células HeLa. Valores representativos:

Trate os números iniciais como um ponto de partida, não como uma regra: a densidade certa depende do tipo celular, de quanto tempo o experimento dura e da velocidade de divisão das células. As áreas de crescimento também variam um pouco entre fabricantes; confira a ficha do produto e substitua a área quando a do seu recipiente for diferente. A recomendação da Corning de 0,2–0,3 mL de meio por cm² é uma boa referência cruzada para frascos e placas de cultura, embora não se estenda aos poços pequenos das microplacas, onde o menisco altera a proporção.

Exemplo prático: doze poços de uma placa de 24 poços

Você quer 20.000 células/cm² em doze poços de uma placa de 24 poços, cada um preenchido com 1 mL, a partir de uma suspensão de 1 × 10⁶ células/mL, com 10% de mistura extra (os valores padrão da calculadora).

1. Células por poço: 20.000 × 1,9 = 38.000, ou seja, 38 µL de suspensão por poço.
2. Mistura para 12 × 1,1 = 13,2 poços: 13,2 mL no total, contendo 38.000 × 13,2 = 501.600 células.
3. Suspensão: 501.600 ÷ 1.000.000 = 0,5016 mL. Meio fresco: 13,2 − 0,5016 = 12,7 mL.
4. Distribua 1 mL da mistura em cada poço.

Quando a suspensão está diluída demais

Se as suas células estiverem a 10.000 células/mL, colocar 38.000 em um poço exige 3,8 mL de suspensão, mais do que o 1 mL que o poço comporta. A calculadora sinaliza isso em vez de informar uma quantidade negativa de meio. Centrifugue as células em uma velocidade suave (a Calculadora de RPM para RCF em centrífuga converte o × g de um protocolo para as rpm do seu rotor), descarte o sobrenadante e ressuspenda em um volume menor; depois conte de novo antes de semear.

Erros comuns

• Contar células mortas. Semeie com base na contagem de células vivas e use a viabilidade obtida na contagem com azul de tripano.
• Misturar as unidades. Células por cm² e células por poço diferem por um fator de 1,9 em uma placa de 24 poços. Confira o que o protocolo quer dizer.
• Não remisturar. As células afundam em minutos, então uma pipeta tirada do topo de um tubo sem mistura tem poucas células.
• Semear os poços da borda. A evaporação nos poços externos de uma placa altera as concentrações; muitos laboratórios os preenchem com tampão ou meio e não os semeiam.
• Esquecer a passagem e o tipo celular. Uma densidade adequada para células HeLa, de crescimento rápido, vai superlotar linhagens mais lentas ou que sofrem inibição por contato.

Perguntas frequentes

Como calcular quantas células semear por poço?

Multiplique a densidade-alvo em células/cm² pela área de crescimento do poço em cm². Um poço de uma placa de 24 poços tem cerca de 1,9 cm², então 20.000 células/cm² significam 38.000 células por poço. Se o seu protocolo fornecer diretamente as células por poço, informe esse valor.

Como calcular o volume de suspensão celular a adicionar?

Divida o número de células necessário pelas células por mililitro da sua suspensão. 38.000 células de uma suspensão de 1 × 10⁶ células/mL correspondem a 0,038 mL, ou 38 µL. Para muitos poços, prepare uma única mistura de semeadura e divida-a.

Quantas células devo semear em uma placa de 24 poços?

A tabela da Thermo Fisher sugere cerca de 50.000 células por poço para células HeLa, o que equivale a cerca de 26.000 células/cm². O número certo depende da linhagem celular e de quanto tempo a cultura dura: use menos células para uma cultura mais longa ou para células de crescimento rápido, e mais se elas precisarem estar confluentes no dia seguinte.

Quantas células há em um frasco T-75 confluente?

A Thermo Fisher indica cerca de 8,4 × 10⁶ células HeLa na confluência em um frasco T-75 (75 cm²), aproximadamente 112.000 células/cm². Isso varia muito conforme o tipo e o tamanho celular, então use-o apenas como um guia aproximado.

Por que acrescentar volume extra à mistura de semeadura?

Há perda de líquido nas paredes do tubo e na ponta da pipeta, então uma mistura preparada exatamente para N poços deixa o último poço com menos. 10% extra é o usual; com poucos poços, prepare a mistura para mais um poço.

O volume de meio altera o número de células?

Não. O número de células por poço é definido pela densidade e pela área. O volume em que você semeia altera apenas a diluição das células e a fração desse volume que a suspensão ocupa.