حاسبة زرع الخلايا
اختر اللوحة أو الطبق أو القارورة، واضبط الكثافة المطلوبة بالخلايا لكل سم² أو بالخلايا لكل بئر، وأدخل تركيز معلّق خلاياك. تعيد الحاسبة حجم المعلّق والوسط الطازج للخليط الكامل للزرع، وكمية ما يوضع في كل بئر، وإجمالي عدد الخلايا اللازم. تعمل بالكامل في متصفحك. مجانية، ودون تسجيل.
استخدم الرقم الذي يعطيه مصنّع وعائك إن اختلف عن الجدول.
من عدّ خلاياك، مثلًا بالهيموسيتومتر.
الخلايا مع الوسط بعد الزرع.
يعوّض الفاقد عند السحب بالماصة؛ و10% شائعة.
النتائج
0.5016
معلّق الخلايا الذي تأخذه (مل)
12.7
الوسط الطازج الذي تضيفه (مل)
38,000
الخلايا لكل بئر أو وعاء
38
المعلّق لكل بئر أو وعاء (ميكرولتر)
501,600
إجمالي الخلايا اللازمة
20,000
الكثافة المحققة (خلية/سم²)
خليط الزرع
| المكوّن | الحجم (مل) |
|---|---|
| معلّق الخلايا | 0.5016 |
| وسط طازج | 12.7 |
| إجمالي خليط الزرع | 13.2 |
امزج برفق، ثم وزّع 1 مل في كل واحد من الآبار أو الأوعية البالغ عددها 12.
الحساب
الخلايا لكل وعاء = 20,000 خلية/سم² × 1.9 سم² = 38,000
المعلّق = الخلايا اللازمة ÷ التركيز = 501,600 ÷ 1 × 10⁶ = 0.5016 مل
كيفية استخدام حاسبة زرع الخلايا
- 1. اختر الوعاء. تأتي مساحة النمو من الجدول الموجود في الحاسبة. وإن اختلفت مساحة لوحتك، فاكتبها في خانة التجاوز.
- 2. حدّد الكثافة. أدخل الخلايا لكل سم² (مفيدة عند التنقّل بين الأحجام المختلفة)، أو الخلايا لكل بئر، وهي الصيغة التي تُكتب بها أغلب البروتوكولات. والزر بجوار الوعاء يملأ عدد البداية الذي تقدّمه Thermo Fisher.
- 3. أدخل المعلّق. استخدم التركيز الناتج عن عدّك، والحجم الكلي الذي تريده في كل بئر بعد إضافة الخلايا. وأضف خليطًا إضافيًا لتعويض الفاقد عند السحب بالماصة.
- 4. حضّر خليط الزرع. اجمع الحجوم المعروضة للمعلّق والوسط الطازج، وامزجها برفق، ووزّع الكمية نفسها في كل بئر.
الحساب
الخلايا لكل بئر
الخلايا لكل بئر = الكثافة (خلية/سم²) × مساحة النمو (سم²)
المعلّق
حجم المعلّق (مل) = إجمالي الخلايا اللازمة ÷ الخلايا/مل في المعلّق
الوسط
الوسط الطازج = حجم خليط الزرع − المعلّق
يُحضَّر خليط الزرع في أنبوب واحد لجميع الآبار، لعدد N × (1 + الهامش)، حتى لا تنقص البئر الأخيرة، ولا يشكّل المعلّق إلا جزءًا صغيرًا منه. فإعداد خليط واحد ثم توزيعه أسرع، ويعطي آبارًا أكثر تجانسًا من إضافة الخلايا إلى كل بئر على حدة. اعدّ المعلّق أولًا (Hemocytometer Cell Count Calculator تحوّل عدّ المربعات إلى خلايا/مل)، وأعد تعليق الخلايا جيدًا قبل كل خطوة، لأنها تترسّب بسرعة.
مساحات النمو وأعداد البداية
يُؤخذ جدول الأوعية في الحاسبة من Useful Numbers for Cell Culture الصادر عن Thermo Fisher Scientific (Gibco Cell Culture Basics)، حيث قيست أعداد البداية باستخدام خلايا HeLa. وهذه قيم تمثيلية:
| الوعاء | مساحة النمو (سم²) | عدد البداية | وسط النمو (مل) |
|---|---|---|---|
| لوحة 6 آبار | 9.6 | 0.3 × 10⁶ لكل بئر | 1–3 |
| لوحة 12 بئرًا | 3.5 | 0.1 × 10⁶ لكل بئر | 1–2 |
| لوحة 24 بئرًا | 1.9 | 0.05 × 10⁶ لكل بئر | 0.5–1.0 |
| لوحة 96 بئرًا | 0.32 | 0.01 × 10⁶ لكل بئر | 0.1–0.2 |
| طبق 100 مم | 56.7 | 2.2 × 10⁶ | 12 |
| قارورة T-75 | 75 | 2.1 × 10⁶ | 8–15 |
تعامل مع أعداد البداية بوصفها نقطة انطلاق لا قاعدة: فالكثافة المناسبة تعتمد على نوع الخلية، ومدة التجربة، وسرعة انقسام الخلايا. كما تختلف مساحات النمو قليلًا بين الشركات المصنِّعة، فراجع ورقة المنتج واستبدل المساحة حين يختلف رقم وعائك. وتصلح توصية Corning بـ 0.2–0.3 مل من الوسط لكل سم² مرجعًا مفيدًا للتحقق في القوارير والأطباق، لكنها لا تنطبق على الآبار الصغيرة في الألواح الدقيقة، حيث يغيّر المنحنى السطحي للسائل النسبة.
مثال تطبيقي: اثنا عشر بئرًا من لوحة 24 بئرًا
تريد 20,000 خلية/سم² في اثني عشر بئرًا من لوحة 24 بئرًا، يُملأ كل منها إلى 1 مل، من معلّق تركيزه 1 × 10⁶ خلية/مل، مع 10% خليط إضافي (القيم الافتراضية للحاسبة).
- الخلايا لكل بئر: 20,000 × 1.9 = 38,000، أي 38 ميكرولترًا من المعلّق لكل بئر.
- خليط لـ 12 × 1.1 = 13.2 بئرًا: 13.2 مل في المجموع تحتوي على 38,000 × 13.2 = 501,600 خلية.
- المعلّق: 501,600 ÷ 1,000,000 = 0.5016 مل. الوسط الطازج: 13.2 − 0.5016 = 12.7 مل.
- وزّع 1 مل من الخليط في كل بئر.
حين يكون المعلّق مخفَّفًا أكثر من اللازم
إن كانت خلاياك بتركيز 10,000 خلية/مل، فإن إدخال 38,000 خلية في البئر يحتاج إلى 3.8 مل من المعلّق، وهو أكثر من 1 مل يتسعه البئر. وتنبّهك الحاسبة إلى ذلك بدلًا من أن تُظهر كمية سالبة من الوسط. اطرد الخلايا بالطرد المركزي بسرعة لطيفة (Centrifuge RPM to RCF Calculator تحوّل قيمة × g في البروتوكول إلى دورات الدقيقة (rpm) الخاصة بدوّارك)، ثم تخلّص من الطافي وأعد التعليق في حجم أصغر، ثم أعد العدّ قبل الزرع.
أخطاء شائعة
- عدّ الخلايا الميتة. ازرع بناءً على عدد الخلايا الحيّة، واستخدم نسبة الحياة من عدّ صبغة تريبان الأزرق.
- خلط الوحدات. يفصل بين الخلايا لكل سم² والخلايا لكل بئر عامل قدره 1.9 في لوحة 24 بئرًا. تحقّق من المقصود في البروتوكول.
- عدم إعادة الخلط. الخلايا تترسّب خلال دقائق، فالماصة المأخوذة من أعلى أنبوب لم يُعَد خلطه تحتوي على خلايا أقل.
- زرع الآبار الطرفية. التبخّر في الآبار الخارجية للوحة يغيّر التركيزات؛ ولذلك يملأ كثير من المختبرات هذه الآبار بمحلول منظِّم أو بوسط، ويتركونها دون زرع.
- إغفال رقم المرّة ونوع الخلية. كثافة تناسب خلايا HeLa سريعة النمو ستُفرط في النمو على خطوط أبطأ أو على خطوط مثبَّطة بالتلامس.
الأسئلة الشائعة
- كيف تحسب عدد الخلايا اللازم زرعها في كل بئر؟
- اضرب الكثافة المستهدفة بالخلايا/سم² في مساحة نمو البئر بالسم². فبئر في لوحة 24 بئرًا مساحته نحو 1.9 سم²، لذا تعني 20,000 خلية/سم² أن كل بئر يحتاج 38,000 خلية. وإن أعطاك بروتوكولك الخلايا لكل بئر مباشرة، فأدخلها.
- كيف أحسب حجم معلّق الخلايا الذي أضيفه؟
- اقسم عدد الخلايا اللازم على عدد الخلايا لكل مليلتر في معلّقك. فـ 38,000 خلية من معلّق تركيزه 1 × 10⁶ خلية/مل تساوي 0.038 مل، أي 38 ميكرولترًا. وفي حالة آبار كثيرة، حضّر خليطًا واحدًا للزرع ثم قسّمه.
- كم خلية أزرع في لوحة 24 بئرًا؟
- يقترح جدول Thermo Fisher نحو 50,000 خلية لكل بئر لخلايا HeLa، أي نحو 26,000 خلية/سم². والعدد الصحيح يعتمد على خط الخلايا ومدة التجربة: استخدم عددًا أقل للثقافات الأطول أو للخلايا سريعة النمو، وعددًا أكبر إن كان يجب أن تبلغ الخلايا الالتقاء في اليوم التالي.
- كم خلية توجد في قارورة T-75 عند الالتقاء؟
- تذكر Thermo Fisher نحو 8.4 × 10⁶ خلية HeLa عند الالتقاء في قارورة T-75 (75 سم²)، أي نحو 112,000 خلية/سم². ويختلف هذا كثيرًا باختلاف نوع الخلية وحجمها، فاستخدمه تقديرًا تقريبيًا فقط.
- لماذا أضيف حجمًا إضافيًا إلى خليط الزرع؟
- يفقد السائل جزءًا منه على جدران الأنبوب ورأس الماصة، فالخليط المُعَدّ لعدد N من الآبار بالضبط سيترك البئر الأخيرة ناقصة. و10% إضافية شائعة؛ ومع عدد قليل من الآبار، حضّر الخليط لبئر إضافية واحدة بدلًا من ذلك.
- هل يغيّر حجم الوسط عدد الخلايا؟
- لا. فعدد الخلايا في كل بئر تحدده الكثافة والمساحة. أما حجم الزرع فلا يغيّر إلا مدى تخفيف الخلايا، ومقدار ما يشغله المعلّق من ذلك الحجم.