Калькулятор посева клеток

Результаты

Как пользоваться калькулятором посева клеток

1. 1. Выберите сосуд. Площадь роста берётся из таблицы калькулятора. Если площадь вашего планшета отличается, введите её в поле переопределения.
2. 2. Задайте плотность. Введите клетки на см² (удобно при переходе между форматами) или клетки на лунку, так её чаще всего записывают в протоколах. Кнопка рядом с сосудом подставляет стартовое число Thermo Fisher.
3. 3. Введите суспензию. Используйте концентрацию из вашего подсчёта и общий объём, который должен быть в каждой лунке после посева. Добавьте запас смеси, чтобы компенсировать потери при пипетировании.
4. 4. Приготовьте смесь для посева. Смешайте объёмы суспензии и свежей среды, указанные в результате, аккуратно перемешайте и разлейте одинаковое количество в каждую лунку.

Расчёт

Смесь для посева готовят в одной пробирке на все лунки — на N × (1 + запас) лунок, чтобы последняя не оказалась недолитой; суспензия при этом составляет лишь небольшую часть смеси. Одна смесь, которую затем разливают, быстрее, и лунки получаются заметно более однородными, чем при добавлении клеток в каждую лунку отдельно. Сначала подсчитайте суспензию (калькулятор подсчёта клеток в камере Горяева переводит подсчёт по квадратам в клетки/мл), и перед каждым действием тщательно ресуспендируйте клетки, потому что они быстро оседают.

Площади роста и стартовые числа

Таблица сосудов в калькуляторе взята из Useful Numbers for Cell Culture компании Thermo Fisher Scientific (Gibco Cell Culture Basics), где стартовые числа измерялись на клетках HeLa. Типичные значения:

Стартовые числа — отправная точка, а не правило: нужная плотность зависит от типа клеток, длительности эксперимента и скорости их деления. Площади роста тоже немного различаются у разных производителей, поэтому сверяйтесь с паспортом продукта и переопределяйте площадь, если у вашего сосуда другое значение. Рекомендация Corning — 0,2–0,3 мл среды на см² — удобная проверка для флаконов и чашек, хотя она не распространяется на маленькие лунки микропланшетов, где мениск меняет соотношение.

Пример: двенадцать лунок 24-луночного планшета

Вы хотите 20 000 клеток/см² в двенадцати лунках 24-луночного планшета, каждая заполнена до 1 мл, из суспензии 1 × 10⁶ клеток/мл, с запасом смеси 10% (значения по умолчанию в калькуляторе).

1. Клетки на лунку: 20 000 × 1,9 = 38 000, то есть 38 мкл суспензии на лунку.
2. Смесь на 12 × 1,1 = 13,2 лунки: 13,2 мл всего, в которых 38 000 × 13,2 = 501 600 клеток.
3. Суспензия: 501 600 ÷ 1 000 000 = 0,5016 мл. Свежая среда: 13,2 − 0,5016 = 12,7 мл.
4. Разлейте по 1 мл смеси в каждую лунку.

Когда суспензия слишком разбавлена

Если в вашей суспензии 10 000 клеток/мл, чтобы попасть на 38 000 клеток в лунку, потребуется 3,8 мл суспензии — больше, чем вмещает лунка (1 мл). Калькулятор сообщает об этом вместо отрицательного объёма среды. Осадите клетки мягким центрифугированием (калькулятор перевода об/мин в RCF переводит × g из протокола в об/мин для вашего ротора), слейте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в меньшем объёме, затем пересчитайте их перед посевом.

Типичные ошибки

• Подсчёт мёртвых клеток. Засевайте по числу живых клеток и используйте жизнеспособность из подсчёта с трипановым синим.
• Смешение единиц. Клетки/см² и клетки на лунку в 24-луночном планшете различаются в 1,9 раза. Проверьте, что имеется в виду в протоколе.
• Отсутствие ресуспендирования. Клетки оседают за несколько минут, поэтому пипетка, взятая из верхней части неперемешанной пробирки, содержит мало клеток.
• Посев в крайних лунках. Испарение в наружных лунках планшета меняет концентрации; многие лаборатории заполняют их буфером или средой и не засевают.
• Забытые пассаж и тип клеток. Плотность, подходящая для быстрорастущих клеток HeLa, приведёт к переполнению медленнее растущих или контактно-ингибируемых линий.

Часто задаваемые вопросы

Как рассчитать, сколько клеток засевать в лунку?

Умножьте целевую плотность в клетках/см² на площадь роста лунки в см². В лунке 24-луночного планшета около 1,9 см², поэтому 20 000 клеток/см² означают 38 000 клеток на лунку. Если протокол даёт число клеток на лунку напрямую, введите его.

Как рассчитать объём клеточной суспензии для добавления?

Разделите нужное число клеток на концентрацию клеток в миллилитре вашей суспензии. 38 000 клеток из суспензии 1 × 10⁶ клеток/мл — это 0,038 мл, или 38 мкл. Если лунок много, приготовьте одну смесь для посева и разлейте её.

Сколько клеток засевать в 24-луночный планшет?

Таблица Thermo Fisher предлагает около 50 000 клеток на лунку для HeLa, что составляет около 26 000 клеток/см². Нужное число зависит от линии клеток и длительности эксперимента: меньше клеток — для более долгой культуры или быстрорастущих клеток, больше — если клетки должны быть конфлюэнтными уже на следующий день.

Сколько клеток во флаконе T-75 при конфлюэнтности?

Thermo Fisher приводит около 8,4 × 10⁶ клеток HeLa при конфлюэнтности во флаконе T-75 (75 см²), примерно 112 000 клеток/см². Это сильно зависит от типа и размера клеток, поэтому используйте это значение только как грубый ориентир.

Зачем добавлять лишний объём в смесь для посева?

Жидкость теряется на стенках пробирки и кончике пипетки, поэтому смесь, приготовленная ровно на N лунок, оставит последнюю лунку недолитой. Обычно добавляют 10%; если лунок мало, приготовьте смесь на одну лунку больше.

Меняет ли объём среды число клеток?

Нет. Число клеток в лунке задаётся плотностью и площадью. Объём, в котором вы засеваете, меняет только то, насколько разбавлены клетки, и какую часть этого объёма занимает суспензия.