Công Cụ Tính Mật Độ Gieo Tế Bào
Chọn đĩa giếng, đĩa nuôi cấy hoặc bình, đặt mật độ bạn muốn theo tế bào/cm² hoặc tế bào mỗi giếng, rồi nhập nồng độ dịch huyền phù tế bào. Công cụ trả về thể tích dịch huyền phù và môi trường mới cho toàn bộ hỗn hợp gieo, lượng cần cho mỗi giếng, và tổng số tế bào bạn cần. Chạy hoàn toàn trong trình duyệt của bạn. Miễn phí, không cần đăng ký.
Dùng số liệu của nhà sản xuất dụng cụ nếu khác với bảng.
Lấy từ kết quả đếm của bạn, ví dụ bằng buồng đếm.
Tế bào cộng với môi trường sau khi gieo.
Bù cho hao hụt khi hút; 10% là phổ biến.
Kết quả
0,5016
Dịch huyền phù tế bào cần lấy (mL)
12,7
Môi trường mới cần thêm (mL)
38.000
Tế bào mỗi giếng hoặc dụng cụ
38
Dịch huyền phù mỗi giếng hoặc dụng cụ (µL)
501.600
Tổng số tế bào cần
20.000
Mật độ đạt được (tế bào/cm²)
Hỗn hợp gieo
| Thành phần | Thể tích (mL) |
|---|---|
| Dịch huyền phù tế bào | 0,5016 |
| Môi trường mới | 12,7 |
| Tổng hỗn hợp gieo | 13,2 |
Trộn nhẹ nhàng, rồi phân phối 1 mL vào mỗi giếng hoặc dụng cụ trong số 12 giếng hoặc dụng cụ.
Phép tính
tế bào mỗi dụng cụ = 20.000 tế bào/cm² × 1,9 cm² = 38.000
dịch huyền phù = số tế bào cần ÷ nồng độ = 501.600 ÷ 1 × 10⁶ = 0,5016 mL
Cách Sử Dụng Công Cụ Tính Mật Độ Gieo Tế Bào
- 1. Chọn dụng cụ. Diện tích nuôi cấy lấy từ bảng trong công cụ. Nếu diện tích của đĩa bạn dùng khác, hãy nhập vào ô ghi đè.
- 2. Đặt mật độ. Nhập theo tế bào/cm² (hữu ích khi bạn chuyển giữa các loại đĩa) hoặc tế bào mỗi giếng, cách mà nhiều quy trình viết. Nút cạnh dụng cụ điền số lượng khởi đầu của Thermo Fisher.
- 3. Nhập dịch huyền phù. Dùng nồng độ từ lần đếm của bạn, và tổng thể tích bạn muốn có trong mỗi giếng sau khi tế bào đã vào. Thêm hỗn hợp dư để bù cho hao hụt khi hút.
- 4. Làm hỗn hợp gieo. Kết hợp các thể tích hiển thị cho dịch huyền phù và môi trường mới, trộn nhẹ nhàng, rồi phân phối cùng một lượng vào mỗi giếng.
Phép Tính
Tế bào mỗi giếng
tế bào mỗi giếng = mật độ (tế bào/cm²) × diện tích nuôi cấy (cm²)
Dịch huyền phù
thể tích dịch huyền phù (mL) = tổng số tế bào cần ÷ tế bào/mL trong dịch huyền phù
Môi trường
môi trường mới = thể tích hỗn hợp gieo − dịch huyền phù
Hỗn hợp gieo được làm trong một ống cho tất cả các giếng, với số lượng N × (1 + phần dư) giếng để giếng cuối không bị thiếu, và dịch huyền phù chỉ chiếm một phần nhỏ trong đó. Làm một hỗn hợp rồi phân phối, thay vì thêm tế bào vào từng giếng, nhanh hơn và cho các giếng đồng đều hơn nhiều. Hãy đếm dịch huyền phù trước (Hemocytometer Cell Count Calculator chuyển số đếm ô vuông thành tế bào/mL), và trộn kỹ trước mỗi bước vì tế bào lắng rất nhanh.
Diện Tích Nuôi Cấy và Số Lượng Khởi Đầu
Bảng dụng cụ của công cụ được lấy từ Useful Numbers for Cell Culture của Thermo Fisher Scientific (Gibco Cell Culture Basics), trong đó số lượng khởi đầu được đo với tế bào HeLa. Các giá trị tiêu biểu:
| Dụng cụ | Diện tích nuôi cấy (cm²) | Số lượng khởi đầu | Môi trường nuôi cấy (mL) |
|---|---|---|---|
| Đĩa 6 giếng | 9,6 | 0,3 × 10⁶ mỗi giếng | 1–3 |
| Đĩa 12 giếng | 3,5 | 0,1 × 10⁶ mỗi giếng | 1–2 |
| Đĩa 24 giếng | 1,9 | 0,05 × 10⁶ mỗi giếng | 0,5–1,0 |
| Đĩa 96 giếng | 0,32 | 0,01 × 10⁶ mỗi giếng | 0,1–0,2 |
| Đĩa 100 mm | 56,7 | 2,2 × 10⁶ | 12 |
| Bình T-75 | 75 | 2,1 × 10⁶ | 8–15 |
Hãy coi số lượng khởi đầu là điểm bắt đầu, không phải quy tắc: mật độ đúng phụ thuộc vào loại tế bào, thí nghiệm kéo dài bao lâu và tế bào phân chia nhanh đến đâu. Diện tích nuôi cấy cũng khác đôi chút giữa các nhà sản xuất, nên hãy kiểm tra phiếu sản phẩm và ghi đè diện tích khi số liệu của dụng cụ bạn khác. Hướng dẫn của Corning về 0,2–0,3 mL môi trường mỗi cm² là một đối chiếu hữu ích cho bình và đĩa, dù nó không áp dụng cho các giếng nhỏ của đĩa vi thể, nơi mặt khum làm thay đổi tỷ lệ.
Ví Dụ Minh Họa: Mười Hai Giếng Của Đĩa 24 Giếng
Bạn muốn 20.000 tế bào/cm² trong mười hai giếng của đĩa 24 giếng, mỗi giếng đầy 1 mL, từ dịch huyền phù 1 × 10⁶ tế bào/mL, với 10% hỗn hợp dư (giá trị mặc định của công cụ).
- Tế bào mỗi giếng: 20.000 × 1,9 = 38.000, tức 38 µL dịch huyền phù mỗi giếng.
- Hỗn hợp cho 12 × 1,1 = 13,2 giếng: 13,2 mL tổng cộng, chứa 38.000 × 13,2 = 501.600 tế bào.
- Dịch huyền phù: 501.600 ÷ 1.000.000 = 0,5016 mL. Môi trường mới: 13,2 − 0,5016 = 12,7 mL.
- Phân phối 1 mL hỗn hợp vào mỗi giếng.
Khi Dịch Huyền Phù Quá Loãng
Nếu tế bào của bạn ở 10.000 tế bào/mL, để đưa 38.000 tế bào vào một giếng cần 3,8 mL dịch huyền phù, nhiều hơn 1 mL mà giếng chứa được. Công cụ sẽ cảnh báo thay vì báo một lượng môi trường âm. Hãy ly tâm tế bào ở tốc độ nhẹ (Công Cụ Chuyển Đổi RPM Sang RCF Cho Máy Ly Tâm chuyển × g của quy trình sang rpm cho rôto của bạn), bỏ phần dịch nổi, hòa tan lại trong thể tích nhỏ hơn, rồi đếm lại trước khi gieo.
Những Lỗi Thường Gặp
- Đếm cả tế bào chết. Hãy gieo theo số đếm tế bào sống, và dùng tỷ lệ sống từ lần đếm bằng xanh trypan.
- Lẫn lộn đơn vị. Tế bào trên cm² và tế bào mỗi giếng chênh nhau 1,9 lần trong đĩa 24 giếng. Hãy kiểm tra quy trình muốn nói đơn vị nào.
- Không trộn lại. Tế bào lắng trong vài phút, nên pipet lấy từ phần trên của ống chưa trộn sẽ có ít tế bào.
- Gieo vào giếng ở rìa. Bay hơi ở các giếng ngoài cùng của đĩa làm thay đổi nồng độ; nhiều phòng thí nghiệm đổ đầy đệm hoặc môi trường vào các giếng này và không gieo.
- Quên số lần cấy chuyền và loại tế bào. Mật độ phù hợp với tế bào HeLa tăng nhanh sẽ khiến các dòng chậm hơn, hoặc các dòng bị ức chế tiếp xúc, phát triển quá mức.
Câu Hỏi Thường Gặp
- Làm sao tính số tế bào cần gieo mỗi giếng?
- Nhân mật độ mục tiêu tính theo tế bào/cm² với diện tích nuôi cấy của giếng tính theo cm². Một giếng của đĩa 24 giếng có khoảng 1,9 cm², nên 20.000 tế bào/cm² nghĩa là 38.000 tế bào mỗi giếng. Nếu quy trình của bạn đưa ra trực tiếp số tế bào mỗi giếng, hãy nhập số đó.
- Làm sao tính thể tích dịch huyền phù tế bào cần thêm?
- Chia số tế bào cần có cho số tế bào trên mililít trong dịch huyền phù. 38.000 tế bào từ dịch huyền phù 1 × 10⁶ tế bào/mL là 0,038 mL, tức 38 µL. Với nhiều giếng, hãy làm một hỗn hợp gieo rồi chia ra.
- Nên gieo bao nhiêu tế bào vào đĩa 24 giếng?
- Bảng của Thermo Fisher gợi ý khoảng 50.000 tế bào mỗi giếng cho tế bào HeLa, tức khoảng 26.000 tế bào/cm². Số lượng đúng phụ thuộc vào dòng tế bào và thí nghiệm kéo dài bao lâu: dùng ít tế bào hơn cho nuôi cấy dài hoặc dòng tăng trưởng nhanh, và nhiều hơn nếu tế bào phải phủ kín vào ngày hôm sau.
- Có bao nhiêu tế bào trong bình T-75 đã phủ kín?
- Thermo Fisher ghi khoảng 8,4 × 10⁶ tế bào HeLa khi phủ kín trong bình T-75 (75 cm²), tức khoảng 112.000 tế bào/cm². Con số này thay đổi nhiều theo loại và kích thước tế bào, nên chỉ nên xem là hướng dẫn thô.
- Tại sao phải thêm thể tích dư vào hỗn hợp gieo?
- Chất lỏng bị giữ lại ở thành ống và đầu pipet, nên một hỗn hợp chỉ làm đủ cho N giếng sẽ làm thiếu giếng cuối. 10% dư là phổ biến; nếu chỉ có vài giếng, hãy làm hỗn hợp dư thêm một giếng.
- Thể tích môi trường có làm thay đổi số tế bào không?
- Không. Số tế bào mỗi giếng được quyết định bởi mật độ và diện tích. Thể tích gieo chỉ làm thay đổi độ loãng của tế bào và phần thể tích mà dịch huyền phù chiếm.