Hücre Ekim Hesaplayıcı
Plakayı, kültür kabını ya da şişeyi seçin, istediğiniz yoğunluğu cm² başına ya da kuyu başına hücre olarak ayarlayın ve hücre süspansiyonunuzun konsantrasyonunu girin. Hesaplayıcı, tüm ekim karışımı için süspansiyon ve taze besiyeri hacmini, her kuyuya konacak miktarı ve ihtiyacınız olan toplam hücre sayısını verir. Tamamen tarayıcınızda çalışır. Ücretsiz, üyelik gerektirmez.
Kabınızın üreticisinin değeri tablodakinden farklıysa onu kullanın.
Hücre sayımınızdan, örneğin bir hemasitometreden.
Ekildikten sonra hücreler artı besiyeri.
Pipetleme kaybını karşılar; %10 yaygındır.
Sonuçlar
0,5016
Alınacak hücre süspansiyonu (mL)
12,7
Eklenecek taze besiyeri (mL)
38.000
Kuyu ya da kap başına hücre
38
Kuyu ya da kap başına süspansiyon (µL)
501.600
Gereken toplam hücre
20.000
Ulaşılan yoğunluk (hücre/cm²)
Ekim karışımı
| Bileşen | Hacim (mL) |
|---|---|
| Hücre süspansiyonu | 0,5016 |
| Taze besiyeri | 12,7 |
| Toplam ekim karışımı | 13,2 |
Nazikçe karıştırın, ardından 12 kuyu ya da kabın her birine 1 mL dağıtın.
Hesap adımları
kap başına hücre = 20.000 hücre/cm² × 1,9 cm² = 38.000
süspansiyon = gereken hücre ÷ konsantrasyon = 501.600 ÷ 1 × 10⁶ = 0,5016 mL
Hücre Ekim Hesaplayıcı Nasıl Kullanılır
- 1. Kabı seçin. Büyüme alanı hesaplayıcıdaki tablodan gelir. Plakanızın alanı farklıysa bunu geçersiz kılma kutusuna yazın.
- 2. Yoğunluğu ayarlayın. Hücre/cm² (biçimler arasında geçiş yaparken kullanışlıdır) ya da kuyu başına hücre girin; birçok protokol bu şekilde yazılır. Kabın yanındaki düğme, Thermo Fisher'ın başlangıç sayısını doldurur.
- 3. Süspansiyonu girin. Sayımınızdaki konsantrasyonu ve hücreler eklendikten sonra her kuyuda istediğiniz toplam hacmi kullanın. Pipetleme kaybını karşılamak için fazla karışım ekleyin.
- 4. Ekim karışımını hazırlayın. Süspansiyon ve taze besiyeri için gösterilen hacimleri birleştirin, nazikçe karıştırın ve her kuyuya aynı miktarı dağıtın.
Hesaplama
Kuyu başına hücre
kuyu başına hücre = yoğunluk (hücre/cm²) × büyüme alanı (cm²)
Süspansiyon
süspansiyon hacmi (mL) = gereken toplam hücre ÷ süspansiyondaki hücre/mL
Besiyeri
taze besiyeri = ekim karışımının hacmi − süspansiyon
Ekim karışımı, tüm kuyular için tek bir tüpte hazırlanır; son kuyunun eksik kalmaması için N × (1 + fazla) kuyu için yapılır ve süspansiyon bunun yalnızca küçük bir kısmını oluşturur. Hücreleri her kuyuya tek tek eklemek yerine tek bir karışım hazırlayıp dağıtmak daha hızlıdır ve kuyular çok daha düzgün olur. Süspansiyonu önce sayın (Hemasitometre Hücre Sayım Hesaplayıcı kare sayımlarını hücre/mL'ye çevirir) ve hücreler hızla çöktüğü için her adımdan önce iyice yeniden süspanse edin.
Büyüme Alanları ve Başlangıç Sayıları
Hesaplayıcının kap tablosu, Thermo Fisher Scientific'in Useful Numbers for Cell Culture (Gibco Cell Culture Basics) kaynağından alınmıştır; başlangıç sayıları HeLa hücreleriyle ölçülmüştür. Temsili değerler:
| Kap | Büyüme alanı (cm²) | Başlangıç sayısı | Büyütme besiyeri (mL) |
|---|---|---|---|
| 6 kuyulu plaka | 9,6 | 0,3 × 10⁶ kuyu başına | 1–3 |
| 12 kuyulu plaka | 3,5 | 0,1 × 10⁶ kuyu başına | 1–2 |
| 24 kuyulu plaka | 1,9 | 0,05 × 10⁶ kuyu başına | 0,5–1,0 |
| 96 kuyulu plaka | 0,32 | 0,01 × 10⁶ kuyu başına | 0,1–0,2 |
| 100 mm kültür kabı | 56,7 | 2,2 × 10⁶ | 12 |
| T-75 şişe | 75 | 2,1 × 10⁶ | 8–15 |
Başlangıç sayılarını bir başlangıç noktası olarak görün, kural olarak değil: doğru yoğunluk hücre tipine, deneyin ne kadar sürdüğüne ve hücrelerin ne kadar hızlı bölündüğüne bağlıdır. Büyüme alanları üreticiler arasında da biraz farklılık gösterir; bu nedenle ürün bilgi formuna bakın ve kabınızın değeri farklıysa alanı geçersiz kılın. Corning'in kaplar ve kültür kapları için önerdiği cm² başına 0,2–0,3 mL besiyeri, şişeler ve kültür kapları için kullanışlı bir çapraz kontroldür; ancak menisküsün oranı değiştirdiği mikroplakaların küçük kuyularına uygulanmaz.
Çalışılmış Örnek: 24 Kuyulu Plakanın On İki Kuyusu
Bir 24 kuyulu plakanın on iki kuyusunda cm² başına 20.000 hücre istiyorsunuz; her kuyu 1 mL'ye doldurulacak, süspansiyon 1 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonunda olacak ve %10 fazla karışım eklenecektir (hesaplayıcının varsayılanları).
- Kuyu başına hücre: 20.000 × 1,9 = 38.000; bu da kuyu başına 38 µL süspansiyon demektir.
- 13,2 kuyu (12 × 1,1) için karışım: toplam 13,2 mL, içinde 38.000 × 13,2 = 501.600 hücre.
- Süspansiyon: 501.600 ÷ 1.000.000 = 0,5016 mL. Taze besiyeri: 13,2 − 0,5016 = 12,7 mL.
- Karışımdan her kuyuya 1 mL dağıtın.
Süspansiyon Çok Seyreltik Olduğunda
Hücreleriniz 10.000 hücre/mL'deyse, kuyuya 38.000 hücre koymak için 3,8 mL süspansiyon gerekir; bu, kuyunun tuttuğu 1 mL'den fazladır. Hesaplayıcı, negatif bir besiyeri miktarı bildirmek yerine bunu işaretler. Hücreleri yumuşak bir hızda santrifüjleyin (Santrifüj RPM–RCF Hesaplayıcı bir protokoldeki × g değerini rotorunuz için devire çevirir), üstteki sıvıyı atın ve hücreleri daha küçük bir hacimde yeniden süspanse edin; ekimden önce yeniden sayın.
Sık Yapılan Hatalar
- Ölü hücreleri saymak. Ekimi canlı hücre sayımına göre yapın ve canlılığı tripan mavisi sayımından alın.
- Birimleri karıştırmak. Cm² başına hücre ile kuyu başına hücre, 24 kuyulu bir plakada 1,9 kat farklıdır. Protokolün hangisini kastettiğini kontrol edin.
- Yeniden karıştırmamak. Hücreler dakikalar içinde çöker; karıştırılmamış bir tüpün üst kısmından alınan bir pipet hücre bakımından düşük olur.
- Kenar kuyulara ekmek. Plakanın dış kuyularındaki buharlaşma derişimleri değiştirir; birçok laboratuvar bu kuyuları tampon ya da besiyeriyle doldurur ve ekmez.
- Pasajı ve hücre tipini unutmak. Hızlı büyüyen HeLa hücrelerine uygun bir yoğunluk, daha yavaş büyüyen ya da temas inhibisyonu gösteren hatlarda aşırı büyümeye yol açar.
Sık sorulan sorular
- Kuyu başına kaç hücre ekileceği nasıl hesaplanır?
- Hedef yoğunluğu (hücre/cm²) kuyunun büyüme alanıyla (cm²) çarpın. 24 kuyulu plakanın bir kuyusunun yaklaşık 1,9 cm² alanı vardır; dolayısıyla cm² başına 20.000 hücre, kuyu başına 38.000 hücre demektir. Protokolünüz doğrudan kuyu başına hücre veriyorsa onu girin.
- Eklenecek hücre süspansiyonunun hacmi nasıl hesaplanır?
- İhtiyacınız olan hücre sayısını, süspansiyonunuzdaki mililitre başına hücre sayısına bölün. 1 × 10⁶ hücre/mL'lik bir süspansiyondan 38.000 hücre 0,038 mL, yani 38 µL eder. Birçok kuyu için tek bir ekim karışımı hazırlayıp bölün.
- Bir 24 kuyulu plakaya kaç hücre ekmeliyim?
- Thermo Fisher'ın tablosu HeLa hücreleri için kuyu başına yaklaşık 50.000 hücre önerir; bu da yaklaşık cm² başına 26.000 hücre demektir. Doğru sayı hücre hattına ve deneyin ne kadar sürdüğüne bağlıdır: daha uzun kültürler ya da hızlı büyüyenler için daha az, ertesi gün birleşmesi gerekiyorsa daha fazla hücre kullanın.
- Birleşmiş bir T-75 şişede kaç hücre bulunur?
- Thermo Fisher, bir T-75 şişede (75 cm²) birleşme anında yaklaşık 8,4 × 10⁶ HeLa hücresi bildirir; bu da yaklaşık cm² başına 112.000 hücre eder. Hücre tipi ve boyutuna göre büyük ölçüde değişir, bu nedenle yalnızca kaba bir rehber olarak kullanın.
- Ekim karışımına neden fazla hacim eklenir?
- Sıvı tüpün ve pipet ucunun duvarlarında kalır; tam olarak N kuyu için hazırlanan bir karışım son kuyuyu eksik bırakır. Genellikle %10 fazla alınır; yalnızca birkaç kuyu varsa bir ekstra kuyu için karışım hazırlayın.
- Besiyeri hacmi hücre sayısını değiştirir mi?
- Hayır. Kuyu başına hücre sayısı yoğunluk ve alanla belirlenir. Ekilen hacim yalnızca hücrelerin ne kadar seyreltik olduğunu ve süspansiyonun bu hacmin ne kadarını kapladığını değiştirir.