Kalkulator obsiewu komórek
Wybierz płytkę, szalkę lub kolbę, ustaw gęstość jako komórki na cm² lub komórki na dołek i wpisz stężenie zawiesiny komórek. Kalkulator zwróci objętość zawiesiny i świeżej pożywki dla całej mieszaniny do zasiewu, ilość na każdy dołek oraz łączną liczbę potrzebnych komórek. Działa w całości w przeglądarce. Za darmo, bez rejestracji.
Użyj wartości podanej przez producenta naczynia, jeśli różni się od tabeli.
Z Twojego liczenia komórek, na przykład w hemocytometrze.
Komórki wraz z pożywką po zasiewie.
Pokrywa straty przy pipetowaniu; 10% to wartość powszechna.
Wyniki
0,5016
Zawiesina komórek do pobrania (ml)
12,7
Świeża pożywka do dodania (ml)
38 000
Komórki na dołek lub naczynie
38
Zawiesina na dołek lub naczynie (µl)
501 600
Łączna liczba potrzebnych komórek
20 000
Osiągnięta gęstość (komórek/cm²)
Mieszanina do zasiewu
| Składnik | Objętość (ml) |
|---|---|
| Zawiesina komórek | 0,5016 |
| Świeża pożywka | 12,7 |
| Całkowita mieszanina do zasiewu | 13,2 |
Delikatnie wymieszaj, a następnie rozdziel po 1 ml do każdego z 12 dołków lub naczyń.
Obliczenia
komórki na naczynie = 20 000 komórek/cm² × 1,9 cm² = 38 000
zawiesina = potrzebne komórki ÷ stężenie = 501 600 ÷ 1 × 10⁶ = 0,5016 ml
Jak korzystać z kalkulatora obsiewu komórek
- 1. Wybierz naczynie. Powierzchnia wzrostu pochodzi z tabeli w kalkulatorze. Jeśli powierzchnia Twojej płytki się różni, wpisz ją w polu nadpisania.
- 2. Ustaw gęstość. Wpisz komórki na cm² (przydatne, gdy przechodzisz między formatami) lub komórki na dołek, czyli sposób, w jaki zapisuje się wiele protokołów. Przycisk obok naczynia wpisuje startową liczbę z tabeli Thermo Fisher.
- 3. Wpisz zawiesinę. Użyj stężenia z liczenia komórek oraz całkowitej objętości, jaką chcesz mieć w każdym dołku po dodaniu komórek. Dodaj nadmiar mieszaniny, aby pokryć straty przy pipetowaniu.
- 4. Przygotuj mieszaninę do zasiewu. Połącz objętości podane dla zawiesiny i świeżej pożywki, delikatnie wymieszaj i rozdziel jednakową ilość do każdego dołka.
Obliczenia
Komórki na dołek
komórki na dołek = gęstość (komórki/cm²) × powierzchnia wzrostu (cm²)
Zawiesina
objętość zawiesiny (ml) = łączna liczba potrzebnych komórek ÷ komórki/ml w zawiesinie
Pożywka
świeża pożywka = objętość mieszaniny do zasiewu − zawiesina
Mieszaninę do zasiewu przygotowuje się w jednej probówce dla wszystkich dołków, dla N × (1 + nadmiar) dołków, aby ostatni nie był niedopełniony, a zawiesina stanowi tylko niewielką jej część. Przygotowanie jednej mieszaniny i rozdzielenie jej jest szybsze i daje znacznie bardziej równomierne dołki niż dodawanie komórek do każdego dołka osobno. Najpierw policz zawiesinę (kalkulator liczby komórek w hemocytometrze zamienia liczby z kwadratów na komórki/ml) i zawsze dokładnie zawieszaj komórki przed każdym krokiem, bo szybko opadają.
Powierzchnie wzrostu i liczby startowe
Tabela naczyń w kalkulatorze pochodzi z Useful Numbers for Cell Culture firmy Thermo Fisher Scientific (Gibco Cell Culture Basics), gdzie liczby startowe zmierzono na komórkach HeLa. Wartości poglądowe:
| Naczynie | Powierzchnia wzrostu (cm²) | Liczba startowa | Pożywka hodowlana (ml) |
|---|---|---|---|
| Płytka 6-dołkowa | 9,6 | 0,3 × 10⁶ na dołek | 1–3 |
| Płytka 12-dołkowa | 3,5 | 0,1 × 10⁶ na dołek | 1–2 |
| Płytka 24-dołkowa | 1,9 | 0,05 × 10⁶ na dołek | 0,5–1,0 |
| Płytka 96-dołkowa | 0,32 | 0,01 × 10⁶ na dołek | 0,1–0,2 |
| Szalka 100 mm | 56,7 | 2,2 × 10⁶ | 12 |
| Kolba T-75 | 75 | 2,1 × 10⁶ | 8–15 |
Traktuj liczby startowe jako punkt wyjścia, a nie regułę: właściwa gęstość zależy od typu komórek, czasu trwania eksperymentu i szybkości podziałów. Powierzchnie wzrostu różnią się nieco między producentami, więc sprawdź kartę produktu i nadpisz powierzchnię, gdy wartość Twojego naczynia jest inna. Wytyczne Corning dotyczące 0,2–0,3 ml pożywki na cm² są przydatnym sprawdzianem dla kolb i szalek, choć nie dotyczą małych dołków płytek, gdzie menisk zmienia ten stosunek.
Przykład krok po kroku: dwanaście dołków płytki 24-dołkowej
Chcesz uzyskać 20 000 komórek/cm² w dwunastu dołkach płytki 24-dołkowej, każdy wypełniony do 1 ml, z zawiesiny o stężeniu 1 × 10⁶ komórek/ml, z 10% nadmiarem mieszaniny (domyślne wartości kalkulatora).
- Komórki na dołek: 20 000 × 1,9 = 38 000, czyli 38 µl zawiesiny na dołek.
- Mieszanina dla 12 × 1,1 = 13,2 dołka: 13,2 ml w sumie, zawierająca 38 000 × 13,2 = 501 600 komórek.
- Zawiesina: 501 600 ÷ 1 000 000 = 0,5016 ml. Świeża pożywka: 13,2 − 0,5016 = 12,7 ml.
- Rozdziel 1 ml mieszaniny do każdego dołka.
Kiedy zawiesina jest zbyt rozcieńczona
Jeśli Twoje komórki mają 10 000 komórek/ml, aby dostać 38 000 do dołka, potrzeba 3,8 ml zawiesiny, czyli więcej niż 1 ml, jaki mieści dołek. Kalkulator sygnalizuje to zamiast podawać ujemną ilość pożywki. Odwiruj komórki przy łagodnej prędkości (kalkulator RPM na RCF dla wirówki zamienia × g z protokołu na obroty dla Twojego rotora), usuń supernatant i zawieś je w mniejszej objętości, a następnie policz ponownie przed zasiewem.
Częste błędy
- Liczenie martwych komórek. Zasiewaj na podstawie liczby żywych komórek i użyj żywotności z liczenia z błękitem trypanu.
- Mieszanie jednostek. Komórki na cm² i komórki na dołek różnią się 1,9 razy w płytce 24-dołkowej. Sprawdź, co ma na myśli protokół.
- Brak ponownego wymieszania. Komórki opadają w ciągu minut, więc pipeta pobrana z góry nieromieszanej probówki zawiera za mało komórek.
- Zasiew skrajnych dołków. Parowanie w zewnętrznych dołkach płytki zmienia stężenia; wiele laboratoriów wypełnia je buforem lub pożywką i nie zasiewa.
- Pomijanie pasażu i typu komórek. Gęstość odpowiednia dla szybko rosnących komórek HeLa przerośnie wolniej rosnące lub hamowane kontaktem linie.
Najczęstsze pytania
- Jak obliczyć, ile komórek zasiać na dołek?
- Pomnóż docelową gęstość w komórkach/cm² przez powierzchnię wzrostu dołka w cm². Dołek płytki 24-dołkowej ma około 1,9 cm², więc 20 000 komórek/cm² to 38 000 komórek na dołek. Jeśli protokół podaje komórki na dołek bezpośrednio, wpisz tę liczbę.
- Jak obliczyć objętość zawiesiny komórek do dodania?
- Podziel liczbę potrzebnych komórek przez liczbę komórek na mililitr w zawiesinie. 38 000 komórek z zawiesiny o stężeniu 1 × 10⁶ komórek/ml to 0,038 ml, czyli 38 µl. Przy wielu dołkach przygotuj jedną mieszaninę do zasiewu i ją podziel.
- Ile komórek zasiać w płytce 24-dołkowej?
- Tabela firmy Thermo Fisher podaje około 50 000 komórek na dołek dla komórek HeLa, czyli około 26 000 komórek/cm². Właściwa liczba zależy od linii komórkowej i długości eksperymentu: użyj mniej komórek przy dłuższej hodowli lub przy szybko rosnących, a więcej, jeśli komórki mają być konfluentne następnego dnia.
- Ile komórek jest w konfluentnej kolbie T-75?
- Thermo Fisher podaje około 8,4 × 10⁶ komórek HeLa w konfluencji w kolbie T-75 (75 cm²), czyli w przybliżeniu 112 000 komórek/cm². To bardzo zależy od typu i wielkości komórek, więc traktuj to tylko jako orientacyjną wskazówkę.
- Dlaczego dodaje się nadmiar do mieszaniny do zasiewu?
- Płyn ginie na ściankach probówki i w końcówce pipety, więc mieszanina przygotowana dokładnie na N dołków zostawia ostatni dołek niedopełniony. Typowe jest 10% nadmiaru; przy kilku dołkach przygotuj mieszaninę na jeden dołek więcej.
- Czy objętość pożywki zmienia liczbę komórek?
- Nie. Liczbę komórek na dołek określają gęstość i powierzchnia. Objętość, w której zasiewasz, zmienia tylko stopień rozcieńczenia komórek i to, jaką część tej objętości zajmuje zawiesina.