कोशिका बीजारोपण कैलकुलेटर
प्लेट, डिश या फ़्लास्क चुनें, वांछित घनत्व प्रति cm² या प्रति वेल सेट करें, और अपने कोशिका निलंबन की सांद्रता दर्ज करें। कैलकुलेटर पूरे बीजारोपण मिश्रण के लिए निलंबन और ताज़ा माध्यम का आयतन, हर वेल में कितना डालना है, और आपको चाहिए कुल कोशिकाओं की संख्या लौटाता है। पूरी तरह आपके ब्राउज़र में चलता है। निःशुल्क, पंजीकरण आवश्यक नहीं।
यदि यह तालिका से अलग हो तो अपने वेसल निर्माता का आँकड़ा इस्तेमाल करें।
आपकी कोशिका गिनती से, उदाहरण के लिए हीमोसाइटोमीटर से।
बीज डालने के बाद कोशिकाएँ और माध्यम मिलाकर।
पिपेटिंग हानि की भरपाई; 10% आम है।
परिणाम
0.5016
लेने योग्य कोशिका निलंबन (mL)
12.7
जोड़ने योग्य ताज़ा माध्यम (mL)
38,000
प्रति वेल या पात्र कोशिकाएँ
38
प्रति वेल या पात्र निलंबन (µL)
5,01,600
कुल आवश्यक कोशिकाएँ
20,000
प्राप्त घनत्व (कोशिकाएँ/cm²)
बीजारोपण मिश्रण
| घटक | आयतन (mL) |
|---|---|
| कोशिका निलंबन | 0.5016 |
| ताज़ा माध्यम | 12.7 |
| कुल बीजारोपण मिश्रण | 13.2 |
मिश्रण धीरे से मिलाएँ, फिर 12 वेलों या पात्रों में से हर एक में 1 mL डालें।
गणना
प्रति पात्र कोशिकाएँ = 20,000 कोशिकाएँ/cm² × 1.9 cm² = 38,000
निलंबन = आवश्यक कोशिकाएँ ÷ सांद्रता = 5,01,600 ÷ 1 × 10⁶ = 0.5016 mL
कोशिका बीजारोपण कैलकुलेटर का उपयोग कैसे करें
- 1. पात्र चुनें। वृद्धि क्षेत्र कैलकुलेटर की तालिका से आता है। यदि आपकी प्लेट का क्षेत्र अलग है, तो उसे ओवरराइड बॉक्स में लिखें।
- 2. घनत्व सेट करें। प्रति cm² कोशिकाएँ दर्ज करें (जब आप अलग-अलग फ़ॉर्मेट के बीच जाते हैं तब उपयोगी), या प्रति वेल, जिस रूप में अधिकतर प्रोटोकॉल लिखे जाते हैं। पात्र के बगल का बटन Thermo Fisher की प्रारंभिक संख्या भर देता है।
- 3. निलंबन दर्ज करें। अपनी गिनती से सांद्रता लें, और कोशिकाएँ डालने के बाद हर वेल में आप जितना कुल आयतन चाहते हैं वह। पिपेटिंग हानि पूरी करने के लिए अतिरिक्त मिश्रण जोड़ें।
- 4. बीजारोपण मिश्रण बनाएँ। निलंबन और ताज़ा माध्यम के लिए दिखाए गए आयतन मिलाएँ, धीरे से मिलाएँ, और हर वेल में बराबर मात्रा डालें।
अंकगणित
प्रति वेल कोशिकाएँ
प्रति वेल कोशिकाएँ = घनत्व (कोशिकाएँ/cm²) × वृद्धि क्षेत्र (cm²)
निलंबन
निलंबन का आयतन (mL) = आवश्यक कुल कोशिकाएँ ÷ निलंबन में कोशिकाएँ/mL
माध्यम
ताज़ा माध्यम = बीजारोपण मिश्रण का आयतन − निलंबन
बीजारोपण मिश्रण सभी वेलों के लिए एक ही ट्यूब में, N × (1 + अतिरिक्त) वेलों के लिए बनता है, ताकि आखिरी वेल कम न पड़ जाए, और निलंबन उसका केवल एक छोटा हिस्सा होता है। हर वेल में अलग-अलग कोशिकाएँ डालने के बजाय एक मिश्रण बनाकर बाँटना तेज़ है और वेल कहीं अधिक एकसमान बनते हैं। पहले निलंबन गिनें (हीमोसाइटोमीटर कोशिका गणना कैलकुलेटर वर्ग गिनतियों को कोशिकाएँ/mL में बदलता है), और हर चरण से पहले अच्छी तरह फिर से मिलाएँ, क्योंकि कोशिकाएँ जल्दी नीचे बैठ जाती हैं।
वृद्धि क्षेत्र और प्रारंभिक संख्याएँ
कैलकुलेटर की पात्र तालिका Thermo Fisher Scientific की Useful Numbers for Cell Culture (Gibco Cell Culture Basics) से ली गई है, जहाँ प्रारंभिक संख्याएँ HeLa कोशिकाओं से मापी गई थीं। प्रतिनिधि मान:
| पात्र | वृद्धि क्षेत्र (cm²) | प्रारंभिक संख्या | संवर्धन माध्यम (mL) |
|---|---|---|---|
| 6-वेल प्लेट | 9.6 | 0.3 × 10⁶ प्रति वेल | 1–3 |
| 12-वेल प्लेट | 3.5 | 0.1 × 10⁶ प्रति वेल | 1–2 |
| 24-वेल प्लेट | 1.9 | 0.05 × 10⁶ प्रति वेल | 0.5–1.0 |
| 96-वेल प्लेट | 0.32 | 0.01 × 10⁶ प्रति वेल | 0.1–0.2 |
| 100 mm डिश | 56.7 | 2.2 × 10⁶ | 12 |
| T-75 फ़्लास्क | 75 | 2.1 × 10⁶ | 8–15 |
इन प्रारंभिक संख्याओं को नियम नहीं, शुरुआत का बिंदु मानें: सही घनत्व कोशिका प्रकार, प्रयोग कितना लंबा चलता है, और कोशिकाएँ कितनी तेज़ी से विभाजित होती हैं, इस पर निर्भर करता है। वृद्धि क्षेत्र निर्माताओं के बीच थोड़े अलग भी होते हैं, इसलिए उत्पाद शीट जाँचें और जब आपके पात्र का आँकड़ा अलग हो तब क्षेत्र ओवरराइड करें। Corning का मार्गदर्शन, फ़्लास्क और डिश के लिए प्रति cm² 0.2–0.3 mL माध्यम, एक उपयोगी जाँच है, हालाँकि यह माइक्रोप्लेट के छोटे वेलों पर लागू नहीं होता, जहाँ मेनिस्कस अनुपात बदल देता है।
हल किया गया उदाहरण: 24-वेल प्लेट के बारह वेल
आप 24-वेल प्लेट के बारह वेलों में 20,000 cells/cm² चाहते हैं, हर वेल 1 mL तक भरा हुआ, 1 × 10⁶ cells/mL के निलंबन से, 10% अतिरिक्त मिश्रण के साथ (कैलकुलेटर के डिफ़ॉल्ट)।
- प्रति वेल कोशिकाएँ: 20,000 × 1.9 = 38,000, यानी प्रति वेल 38 µL निलंबन।
- 13.2 वेलों (12 × 1.1) के लिए मिश्रण: कुल 13.2 mL, जिसमें 38,000 × 13.2 = 501,600 कोशिकाएँ हैं।
- निलंबन: 501,600 ÷ 1,000,000 = 0.5016 mL। ताज़ा माध्यम: 13.2 − 0.5016 = 12.7 mL।
- हर वेल में मिश्रण का 1 mL डालें।
जब निलंबन बहुत पतला हो
यदि आपकी कोशिकाएँ 10,000 cells/mL पर हैं, तो किसी एक वेल में 38,000 पहुँचाने के लिए 3.8 mL निलंबन चाहिए, जो उस 1 mL से अधिक है जिसे वेल रखता है। कैलकुलेटर ऋणात्मक माध्यम दिखाने के बजाय इसे चिह्नित करता है। कोशिकाओं को धीमी गति से नीचे बैठाएँ (सेंट्रीफ़्यूज़ RPM से RCF कैलकुलेटर प्रोटोकॉल के × g को आपके रोटर के लिए rpm में बदलता है), सुपरनेटेंट (ऊपरी तरल) हटाएँ और कम आयतन में फिर से निलंबित करें, फिर बीज डालने से पहले दोबारा गिनें।
सामान्य गलतियाँ
- मृत कोशिकाएँ गिनना। जीवित-कोशिका गिनती पर बीज डालें, और ट्रिपैन ब्लू गिनती की व्यवहार्यता इस्तेमाल करें।
- इकाइयाँ मिलाना। प्रति cm² और प्रति वेल कोशिकाएँ 24-वेल प्लेट में 1.9 गुना अलग हैं। जाँचें कि प्रोटोकॉल किसकी बात कर रहा है।
- मिश्रण फिर से न मिलाना। कोशिकाएँ मिनटों में नीचे बैठ जाती हैं, इसलिए बिना मिलाई ट्यूब के ऊपर से ली गई पिपेट में कोशिकाएँ कम होती हैं।
- किनारे की वेलों में बीज डालना। प्लेट की बाहरी वेलों में वाष्पीकरण सांद्रता बदल देता है; कई प्रयोगशालाएँ उन्हें बफ़र या माध्यम से भरकर बिना बीज के छोड़ देती हैं।
- पैसेज और कोशिका प्रकार भूलना। जो घनत्व तेज़ी से बढ़ने वाली HeLa कोशिकाओं के लिए ठीक है, वह धीमी या संपर्क-अवरोधी लाइनों को अधिक बढ़ा देगा।
अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
- प्रति वेल कितनी कोशिकाएँ बोने की गणना कैसे करें?
- लक्ष्य घनत्व को cm² में वेल के वृद्धि क्षेत्र से गुणा करें। 24-वेल प्लेट के एक वेल का क्षेत्र लगभग 1.9 cm² है, इसलिए 20,000 cells/cm² का मतलब है प्रति वेल 38,000 कोशिकाएँ। यदि आपका प्रोटोकॉल सीधे प्रति वेल कोशिकाएँ देता है, तो वही दर्ज करें।
- जोड़ने के लिए कोशिका निलंबन का आयतन कैसे निकालें?
- आपको जितनी कोशिकाएँ चाहिए उन्हें अपने निलंबन की प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं से भाग दें। 1 × 10⁶ cells/mL निलंबन से 38,000 कोशिकाएँ 0.038 mL, यानी 38 µL हैं। कई वेलों के लिए एक बीजारोपण मिश्रण बनाएँ और उसे बाँट दें।
- 24-वेल प्लेट में कितनी कोशिकाएँ बोनी चाहिए?
- Thermo Fisher की तालिका HeLa कोशिकाओं के लिए लगभग 50,000 कोशिकाएँ प्रति वेल सुझाती है, जो लगभग 26,000 cells/cm² है। सही संख्या कोशिका लाइन और प्रयोग की अवधि पर निर्भर करती है: लंबी संवर्धन या तेज़ बढ़ने वालों के लिए कम, और यदि कोशिकाएँ अगले दिन संगम पर होनी चाहिए तो अधिक।
- एक संगम T-75 फ़्लास्क में कितनी कोशिकाएँ होती हैं?
- Thermo Fisher संगम पर T-75 फ़्लास्क (75 cm²) में लगभग 8.4 × 10⁶ HeLa कोशिकाएँ बताता है, यानी लगभग 112,000 cells/cm²। यह कोशिका प्रकार और आकार पर बहुत निर्भर करता है, इसलिए इसे केवल मोटे मार्गदर्शन के रूप में लें।
- बीजारोपण मिश्रण में अतिरिक्त आयतन क्यों जोड़ें?
- ट्यूब की दीवारों और पिपेट की नोक में तरल चिपक जाता है, इसलिए ठीक N वेलों के लिए बना मिश्रण आखिरी वेल को कम छोड़ देता है। 10% अतिरिक्त आम है; यदि वेल कम हैं, तो एक अतिरिक्त वेल के लिए मिश्रण बनाएँ।
- क्या माध्यम का आयतन कोशिकाओं की संख्या बदलता है?
- नहीं। प्रति वेल कोशिकाओं की संख्या घनत्व और क्षेत्र से तय होती है। जिस आयतन में आप बीज डालते हैं, वह केवल यह बदलता है कि कोशिकाएँ कितनी पतली हैं, और उस आयतन का कितना हिस्सा निलंबन लेता है।