Calcolatore di semina cellulare
Scegli la piastra, la piastra Petri o la fiasca, imposta la densità che vuoi come cellule per cm² o cellule per pozzetto, e inserisci la concentrazione della tua sospensione cellulare. Il calcolatore restituisce il volume di sospensione e di terreno fresco per tutta la miscela di semina, quanto mettere in ogni pozzetto e il numero totale di cellule necessarie. Funziona interamente nel tuo browser. Gratuito, senza registrazione.
Usa il dato del produttore del tuo contenitore se differisce dalla tabella.
Dalla tua conta cellulare, per esempio con un emocitometro.
Cellule più terreno una volta seminate.
Copre le perdite di pipettaggio; il 10% è comune.
Risultati
0,5016
Sospensione cellulare da prelevare (mL)
12,7
Terreno fresco da aggiungere (mL)
38.000
Cellule per pozzetto o contenitore
38
Sospensione per pozzetto o contenitore (µL)
501.600
Cellule totali necessarie
20.000
Densità raggiunta (cellule/cm²)
Miscela di semina
| Componente | Volume (mL) |
|---|---|
| Sospensione cellulare | 0,5016 |
| Terreno fresco | 12,7 |
| Miscela di semina totale | 13,2 |
Mescola delicatamente, poi distribuisci 1 mL in ciascuno dei 12 pozzetti o contenitori.
Il procedimento
cellule per contenitore = 20.000 cellule/cm² × 1,9 cm² = 38.000
sospensione = cellule necessarie ÷ concentrazione = 501.600 ÷ 1 × 10⁶ = 0,5016 mL
Come usare il calcolatore di semina cellulare
- 1. Scegli il contenitore. L'area di crescita viene dalla tabella del calcolatore. Se l'area della tua piastra è diversa, scrivila nella casella di correzione.
- 2. Imposta la densità. Inserisci le cellule per cm² (utile quando passi da un formato all'altro) oppure le cellule per pozzetto, che è il modo in cui molti protocolli sono scritti. Il pulsante accanto al contenitore inserisce il numero di partenza di Thermo Fisher.
- 3. Inserisci la sospensione. Usa la concentrazione della tua conta e il volume totale che vuoi in ogni pozzetto una volta inserite le cellule. Aggiungi miscela in eccesso per coprire le perdite di pipettaggio.
- 4. Prepara la miscela di semina. Combina i volumi indicati per la sospensione e per il terreno fresco, mescola delicatamente e distribuisci la stessa quantità in ogni pozzetto.
Il calcolo
Cellule per pozzetto
cellule per pozzetto = densità (cellule/cm²) × area di crescita (cm²)
Sospensione
volume di sospensione (mL) = cellule totali necessarie ÷ cellule/mL nella sospensione
Terreno
terreno fresco = volume della miscela di semina − sospensione
La miscela di semina si prepara in un'unica provetta per tutti i pozzetti, per N × (1 + eccesso) pozzetti, così l'ultimo non resta corto, e la sospensione occupa solo una piccola parte del volume. Preparare una sola miscela e distribuirla, invece di aggiungere le cellule pozzetto per pozzetto, è più rapido e dà pozzetti molto più uniformi. Conta prima la sospensione (un Calcolatore della conta cellulare con emocitometro converte i conteggi dei quadrati in cellule/mL), e risospendi bene prima di ogni passaggio, perché le cellule si depositano in fretta.
Aree di crescita e numeri di partenza
La tabella dei contenitori del calcolatore è ricavata da Useful Numbers for Cell Culture di Thermo Fisher Scientific (Gibco Cell Culture Basics), dove i numeri di partenza sono stati misurati con cellule HeLa. Valori rappresentativi:
| Contenitore | Area di crescita (cm²) | Numero di partenza | Terreno di crescita (mL) |
|---|---|---|---|
| Piastra a 6 pozzetti | 9,6 | 0,3 × 10⁶ per pozzetto | 1–3 |
| Piastra a 12 pozzetti | 3,5 | 0,1 × 10⁶ per pozzetto | 1–2 |
| Piastra a 24 pozzetti | 1,9 | 0,05 × 10⁶ per pozzetto | 0,5–1,0 |
| Piastra a 96 pozzetti | 0,32 | 0,01 × 10⁶ per pozzetto | 0,1–0,2 |
| Piastra Petri da 100 mm | 56,7 | 2,2 × 10⁶ | 12 |
| Fiasca T-75 | 75 | 2,1 × 10⁶ | 8–15 |
Tratta i numeri di partenza come un punto di riferimento, non come una regola: la densità giusta dipende dal tipo di cellula, dalla durata dell'esperimento e dalla velocità con cui le cellule si dividono. Anche le aree di crescita differiscono un po' tra produttori, quindi controlla la scheda del prodotto e correggi l'area quando il dato del tuo contenitore è diverso. L'indicazione di Corning di 0,2–0,3 mL di terreno per cm² è un utile controllo per fiasche e piastre Petri, anche se non vale per i piccoli pozzetti delle micropiastre, dove il menisco cambia il rapporto.
Esempio svolto: dodici pozzetti di una piastra a 24 pozzetti
Vuoi 20.000 cellule/cm² in dodici pozzetti di una piastra a 24 pozzetti, riempiti fino a 1 mL, a partire da una sospensione di 1 × 10⁶ cellule/mL, con il 10% di miscela in eccesso (i valori predefiniti del calcolatore).
- Cellule per pozzetto: 20.000 × 1,9 = 38.000, cioè 38 µL di sospensione per pozzetto.
- Miscela per 12 × 1,1 = 13,2 pozzetti: 13,2 mL in totale con 38.000 × 13,2 = 501.600 cellule.
- Sospensione: 501.600 ÷ 1.000.000 = 0,5016 mL. Terreno fresco: 13,2 − 0,5016 = 12,7 mL.
- Distribuisci 1 mL di miscela in ogni pozzetto.
Quando la sospensione è troppo diluita
Se le tue cellule sono a 10.000 cellule/mL, per mettere 38.000 cellule in un pozzetto servono 3,8 mL di sospensione, più dell'1 mL che il pozzetto contiene. Il calcolatore lo segnala invece di riportare una quantità negativa di terreno. Centrifuga le cellule a una velocità delicata (il Calcolatore da RPM a RCF per centrifuga converte il × g di un protocollo negli rpm per il tuo rotore), elimina il surnatante e risospendi in un volume minore, poi conta di nuovo prima di seminare.
Errori comuni
- Contare le cellule morte. Semina in base alla conta delle cellule vive, usando la vitalità del conteggio con blu di tripano.
- Confondere le unità. Cellule per cm² e cellule per pozzetto differiscono di 1,9 volte in una piastra a 24 pozzetti. Controlla a quale delle due si riferisce il protocollo.
- Non rimescolare. Le cellule si depositano in pochi minuti, quindi una pipetta presa dalla parte alta di una provetta non rimescolata ha poche cellule.
- Seminare i pozzetti ai bordi. L'evaporazione nei pozzetti esterni di una piastra altera le concentrazioni; molti laboratori li riempiono di tampone o terreno e li lasciano non seminati.
- Dimenticare il passaggio e il tipo di cellula. Una densità adatta alle HeLa, che crescono rapidamente, sovrafollerà linee più lente o a inibizione da contatto.
Domande frequenti
- Come si calcola quante cellule seminare per pozzetto?
- Moltiplica la densità obiettivo in cellule/cm² per l'area di crescita del pozzetto in cm². Un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti ha circa 1,9 cm², quindi 20.000 cellule/cm² significano 38.000 cellule per pozzetto. Se il tuo protocollo indica direttamente le cellule per pozzetto, inseriscile.
- Come si calcola il volume di sospensione cellulare da aggiungere?
- Dividi il numero di cellule necessarie per le cellule per millilitro della tua sospensione. 38.000 cellule da una sospensione a 1 × 10⁶ cellule/mL corrispondono a 0,038 mL, cioè 38 µL. Per molti pozzetti, prepara un'unica miscela di semina e dividila.
- Quante cellule seminare in una piastra a 24 pozzetti?
- La tabella di Thermo Fisher suggerisce circa 50.000 cellule per pozzetto per le HeLa, cioè circa 26.000 cellule/cm². Il numero giusto dipende dalla linea cellulare e dalla durata dell'esperimento: usane meno per una coltura più lunga o per cellule che crescono rapidamente, e di più se le cellule devono essere confluenti il giorno dopo.
- Quante cellule ci sono in una fiasca T-75 confluente?
- Thermo Fisher indica circa 8,4 × 10⁶ cellule HeLa a confluenza in una fiasca T-75 (75 cm²), cioè circa 112.000 cellule/cm². Varia molto con il tipo e la dimensione della cellula, quindi usalo solo come guida approssimativa.
- Perché aggiungere volume extra alla miscela di semina?
- Del liquido resta attaccato alle pareti della provetta e alla punta della pipetta, quindi una miscela preparata esattamente per N pozzetti lascia l'ultimo corto. Il 10% in più è tipico; con pochi pozzetti, prepara la miscela per un pozzetto in più.
- Il volume del terreno cambia il numero di cellule?
- No. Il numero di cellule per pozzetto è determinato dalla densità e dall'area. Il volume in cui le semini cambia solo quanto le cellule sono diluite e quanto di quel volume occupa la sospensione.