DNA-Konzentrationsrechner

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So verwenden Sie den DNA-Konzentrationsrechner

1. 1. Wählen Sie den Probentyp. dsDNA (Plasmide, PCR-Produkte, genomische DNA), ssDNA, RNA oder ein kurzes Oligonukleotid. Das legt den Umrechnungsfaktor fest und später das Molekulargewicht.
2. 2. Geben Sie die Messwerte ein. Tragen Sie A₂₆₀ ein. Ergänzen Sie A₂₈₀ und A₂₃₀, um die Reinheitsverhältnisse zu erhalten, und einen Leerwert (A₃₂₀), falls Ihr Protokoll einen abzieht. Stellen Sie die Schichtdicke und den Verdünnungsfaktor ein, falls sie nicht 10 mm und 1 betragen.
3. 3. Optional: Volumen und Länge angeben. Das Volumen ergibt die Gesamtausbeute in µg; die Länge (bp für dsDNA, sonst nt) ergibt Molarität und pmol.
4. 4. Lesen Sie das Ergebnis ab. Die Konzentration, die Bewertungen der Reinheit und der vollständige Rechenweg erscheinen gemeinsam. Wechseln Sie in den Modus ng ↔ pmol, um eine DNA-Menge ohne Absorptionsdaten umzurechnen.

Wie A260 zur Konzentration wird

Nukleinsäuren absorbieren ultraviolettes Licht am stärksten bei 260 nm. Nach dem Beer-Lambert-Gesetz ist die Absorption proportional zur Konzentration, sodass ein einziger Umrechnungsfaktor einen Messwert in eine Massenkonzentration verwandelt:

Der Faktor ε hängt vom Typ der Nukleinsäure ab. Die NanoDrop-FAQ von Thermo Fisher nennt diese Werte in ng·cm/µL, und eine technische Notiz von New England Biolabs gibt dieselben drei Werte als µg/mL für eine Schichtdicke von 10 mm an:

Dies sind Mittelwerte für eine typische Basenzusammensetzung. Kurze Oligonukleotide variieren mit ihrer Sequenz — der Extinktionskoeffizient eines Oligos laut Hersteller ist genauer —, und manche Quellen nennen für ssDNA einen anderen Wert, etwa 37 µg/mL. Verwenden Sie das Feld für den Faktor, wenn Ihr Protokoll oder Lieferant einen anderen Faktor vorgibt.

Die Reinheitsverhältnisse lesen

Proteine absorbieren nahe 280 nm, und viele übliche Verunreinigungen absorbieren nahe 230 nm. Deshalb geben zwei Verhältnisse einen schnellen Hinweis darauf, was sonst noch im Röhrchen ist:

• A₂₆₀/A₂₈₀. Etwa 1,8 für saubere DNA (NEB nennt 1,85–1,88 in Puffer) und etwa 2,0–2,1 für RNA. Ein niedriger Wert deutet auf Protein oder Phenol hin; ein hoher Wert in einer DNA-Präparation kann auf RNA-Verschleppung hinweisen. Saure Lösungen zeigen niedrigere, basische höhere Werte, prüfen Sie daher den pH-Wert des Puffers.
• A₂₆₀/A₂₃₀. Ein empfindlicherer Indikator, für saubere Proben meist 2,0–2,4. Guanidinsalze, EDTA, Detergenzien, Phenol und Kohlenhydrate senken ihn. NEB warnt, dass dieses Verhältnis stärker schwankt als A₂₆₀/A₂₈₀ und mit Vorsicht zu lesen ist.
• Die übliche Schwelle. In der Praxis gelten beide Verhältnisse über 1,8 für die meisten nachgelagerten Arbeiten als sauber genug.

Beispiel: eine Plasmid-Mini-Präparation

Ein Plasmid mit 5.000 bp wird in 50 µL eluiert, 1:10 verdünnt und in einer 10-mm-Küvette gemessen: A₂₆₀ = 0,412, A₂₈₀ = 0,222, A₂₃₀ = 0,18. Dies sind die Standardeingaben des Rechners.

1. Konzentration: 0,412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL.
2. Reinheit: 0,412 ÷ 0,222 = 1,86 und 0,412 ÷ 0,18 = 2,29. Beide liegen deutlich im sauberen Bereich.
3. Ausbeute: 206 ng/µL × 50 µL = 10,3 µg DNA im Röhrchen.
4. Molarität: 206 × 1.000 ÷ (660 × 5.000) = 0,06242 pmol/µL = 62,42 nM, was 3,121 pmol im Röhrchen entspricht.

Umrechnung zwischen ng und pmol

Klonierungs- und Ligationsprotokolle sind in Picomol angegeben, ein Spektralphotometer liefert jedoch Nanogramm. Die Umrechnung braucht die Länge und ein mittleres Molekulargewicht pro Basenpaar oder Nukleotid:

Die bekannte Probe: 1 µg eines Fragments mit 1.000 bp sind 1,515 pmol (3,03 pmol Enden), dasselbe wie der Wert von 1,52 pmol pro µg und Kilobase, den Lieferanten angeben. Das Molekulargewicht von 660 g/mol pro Basenpaar ist ein Mittelwert; manche Quellen verwenden 650, was pmol um etwa 1,5 % verändert. Für ein exaktes Oligo-Molekulargewicht verwenden Sie den Wert des Herstellers. Um aus diesen Mengen ein Insert-zu-Vektor-Verhältnis zu planen, nutzen Sie den Ligationsrechner.

Häufige Fehler

• Den Verdünnungsfaktor vergessen. Der Küvettenwert ist die verdünnte Probe; multiplizieren Sie zurück, um die Stammlösung zu erhalten.
• Den dsDNA-Faktor für ein Oligo oder RNA verwenden. Der Unterschied beträgt 33–50 % im Ergebnis.
• Außerhalb des linearen Bereichs messen. Halten Sie A₂₆₀ etwa zwischen 0,1 und 1,5; verdünnen Sie konzentrierte Proben und messen Sie erneut.
• Der Absorption bei allem vertrauen. Freie Nukleotide, RNA und einzelsträngige Fragmente absorbieren alle bei 260 nm. Die Absorption überschätzt daher die Menge intakter doppelsträngiger DNA in einer Rohpräparation. Fluoreszenzfarbstoffe, die spezifisch an dsDNA binden, sind selektiver, wenn das wichtig ist.

Häufig gestellte Fragen

Wie berechnen Sie die DNA-Konzentration aus A260?

Multiplizieren Sie den A260-Wert mit dem Umrechnungsfaktor — 50 ng/µL für doppelsträngige DNA, 33 für einzelsträngige DNA, 40 für RNA — und mit einem eventuellen Verdünnungsfaktor. Ein A260 von 0,412 für dsDNA, 1:10 verdünnt, ergibt 0,412 × 50 × 10 = 206 ng/µL. Bei einer anderen Schichtdicke als 10 mm rechnen Sie mit 10 geteilt durch die Schichtdicke in Millimetern.

Was ist ein guter Wert für A260/A280?

Etwa 1,8 für reine DNA und etwa 2,0 für reine RNA. NEB nennt 1,85–1,88 für saubere dsDNA in Puffer und etwa 2,1 für RNA. Deutlich niedrigere Werte deuten auf Protein- oder Phenolverunreinigung hin; das Verhältnis wird außerdem vom pH-Wert des Puffers verschoben. Betrachten Sie es daher als Richtwert und nicht als Bestanden-oder-Nicht-bestanden-Test.

Was bedeutet ein niedriges A260/A230-Verhältnis?

Etwas anderes als Nukleinsäure absorbiert bei 230 nm. Die üblichen Verursacher sind Guanidinsalze aus Säulenkits, EDTA, Detergenzien, Phenol und Kohlenhydrat-Verschleppung. Eluieren oder fällen Sie die Probe erneut und stellen Sie sicher, dass das Gerät mit demselben Puffer wie die Probe geleert wurde.

Wie rechnen Sie ng DNA in pmol um?

Teilen Sie die Masse in Nanogramm durch das Molekulargewicht, das für dsDNA etwa 660 g/mol pro Basenpaar beträgt, und multiplizieren Sie mit 1.000. Für 100 ng eines Plasmids mit 3.000 bp: 100 × 1.000 ÷ (660 × 3.000) = 0,0505 pmol. Der Rechner oben macht dies in beide Richtungen.

Ist ng/µL dasselbe wie µg/mL?

Ja. Ein Nanogramm pro Mikroliter entspricht 10⁻⁹ g pro 10⁻⁶ L, also 10⁻³ g/L oder 1 µg/mL. Deshalb werden die Umrechnungsfaktoren für A260 in beiden Schreibweisen angegeben, als 50 ng/µL oder 50 µg/mL pro Absorptionseinheit.

Warum weicht mein NanoDrop-Wert von einem Qubit-Wert ab?

Die Absorption erfasst alles, was bei 260 nm absorbiert — RNA, freie Nukleotide und Verunreinigungen —, während ein Fluoreszenzfarbstoff-Test wie Qubit gezielt doppelsträngige DNA bindet. Bei Rohpräparationen ist die Absorption meist der höhere Wert. Bei sauberer, gereinigter dsDNA stimmen beide Werte eng überein.

Mein A260 liegt über 1,5. Kann ich ihn trotzdem verwenden?

Verdünnen Sie die Probe und messen Sie erneut. Die meisten Spektralphotometer verlieren bei hoher Absorption die Linearität, daher unterschätzt ein Wert weit über 1,5 die tatsächliche Konzentration. Geben Sie den Verdünnungsfaktor ein, damit der Rechner das Ergebnis auf die Stammlösung zurückrechnet.