Calculateur de concentration d'ADN

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Comment utiliser le calculateur de concentration d'ADN

1. 1. Choisissez le type d'échantillon. ADN double brin (plasmides, produits de PCR, ADN génomique), ADN simple brin, ARN ou oligonucléotide court. Ce choix fixe le facteur de conversion et, plus tard, la masse moléculaire.
2. 2. Saisissez les lectures. Entrez l'A₂₆₀. Ajoutez l'A₂₈₀ et l'A₂₃₀ pour obtenir les rapports de pureté, ainsi qu'une lecture de fond (A₃₂₀) si votre protocole en soustrait une. Réglez la longueur du trajet optique et le facteur de dilution s'ils ne valent pas 10 mm et 1.
3. 3. Facultatif : ajoutez un volume et une longueur. Le volume donne le rendement total en µg ; la longueur (bp pour l'ADN double brin, nt sinon) ajoute la molarité et les pmol.
4. 4. Lisez le résultat. La concentration, les verdicts de pureté et le calcul complet apparaissent ensemble. Passez au mode ng ↔ pmol pour convertir une quantité d'ADN sans aucune donnée d'absorbance.

Comment l'A260 devient une concentration

Les acides nucléiques absorbent la lumière ultraviolette le plus fortement à 260 nm. Selon la loi de Beer–Lambert, l'absorbance est proportionnelle à la concentration : un seul facteur de conversion transforme donc une lecture en concentration massique :

Le facteur ε dépend du type d'acide nucléique. La FAQ NanoDrop de Thermo Fisher donne ces valeurs, en ng·cm/µL, et une note technique de New England Biolabs donne les mêmes trois valeurs en µg/mL pour un trajet de 10 mm :

Ce sont des moyennes pour une composition en bases typique. Les oligonucléotides courts varient selon leur séquence — le coefficient d'extinction propre à un oligo, fourni par le fabricant, est plus précis — et certaines références donnent une autre valeur pour l'ADN simple brin, comme 37 µg/mL. Utilisez le champ de remplacement si votre protocole ou votre fournisseur indique un autre facteur.

Lire les rapports de pureté

Les protéines absorbent vers 280 nm et de nombreux contaminants courants absorbent vers 230 nm ; deux rapports donnent donc une vérification rapide de ce qui se trouve d'autre dans le tube :

• A₂₆₀/A₂₈₀. Environ 1,8 pour un ADN pur (NEB indique 1,85 à 1,88 dans le tampon) et environ 2,0 à 2,1 pour l'ARN. Une valeur basse indique une protéine ou du phénol ; une valeur haute dans une préparation d'ADN peut signaler de l'ARN entraîné. Les solutions acides donnent une valeur plus basse et les solutions basiques une valeur plus haute : vérifiez donc le pH du tampon.
• A₂₆₀/A₂₃₀. Un indicateur plus sensible, généralement de 2,0 à 2,4 pour des échantillons purs. Les sels de guanidine, l'EDTA, les détergents, le phénol et les glucides la font baisser. NEB met en garde : ce rapport varie davantage que A₂₆₀/A₂₈₀ et doit être lu avec précaution.
• Le seuil courant. En pratique, des rapports supérieurs à 1,8 pour les deux sont considérés comme assez propres pour la plupart des étapes en aval.

Exemple détaillé : un miniprep de plasmide

Un plasmide de 5 000 bp est élué dans 50 µL, dilué au 1/10 et lu dans une cuve de 10 mm : A₂₆₀ = 0,412, A₂₈₀ = 0,222, A₂₃₀ = 0,18. Ce sont les valeurs par défaut du calculateur.

1. Concentration : 0,412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL.
2. Pureté : 0,412 ÷ 0,222 = 1,86 et 0,412 ÷ 0,18 = 2,29. Les deux se situent confortablement dans la plage des échantillons purs.
3. Rendement : 206 ng/µL × 50 µL = 10,3 µg d'ADN dans le tube.
4. Molarité : 206 × 1 000 ÷ (660 × 5 000) = 0,06242 pmol/µL = 62,42 nM, soit 3,121 pmol dans le tube.

Convertir entre ng et pmol

Les recettes de clonage et de ligature sont exprimées en picomoles, alors qu'un spectrophotomètre donne des nanogrammes. La conversion nécessite la longueur et une masse moléculaire moyenne par paire de bases ou par nucléotide :

La vérification classique : 1 µg d'un fragment de 1 000 bp représente 1,515 pmol (3,03 pmol d'extrémités), soit les 1,52 pmol par µg et par kilobase que donnent les fournisseurs. La valeur de 660 g/mol par paire de bases est une moyenne ; certaines sources utilisent 650, ce qui modifie les pmol d'environ 1,5 %. Pour une masse moléculaire exacte d'oligo, utilisez la valeur du fabricant. Pour planifier à partir de ces quantités le rapport insert/vecteur, utilisez le Ligation Calculator.

Erreurs courantes

• Oublier le facteur de dilution. La valeur de la cuve correspond à l'échantillon dilué ; multipliez pour revenir à la solution mère.
• Utiliser le facteur de l'ADN double brin pour un oligo ou de l'ARN. La différence atteint 33 à 50 % sur le résultat.
• Lire hors de la plage linéaire. Gardez l'A₂₆₀ entre environ 0,1 et 1,5 ; diluez les échantillons concentrés et relisez-les.
• Faire confiance à l'absorbance pour tout. Les nucléotides libres, l'ARN et les fragments simple brin absorbent tous à 260 nm : l'absorbance surestime donc la quantité d'ADN double brin intact dans une préparation brute. Les colorants fluorescents spécifiques de l'ADN double brin sont plus sélectifs lorsque cela compte.

Questions fréquentes

Comment calculer la concentration d'ADN à partir de l'A260 ?

Multipliez la lecture A260 par le facteur de conversion — 50 ng/µL pour l'ADN double brin, 33 pour l'ADN simple brin, 40 pour l'ARN — puis par le facteur de dilution éventuel. Une A260 de 0,412 pour de l'ADN double brin dilué au 1/10 donne 0,412 × 50 × 10 = 206 ng/µL. Pour un trajet différent de 10 mm, multipliez par 10 divisé par la longueur du trajet en millimètres.

Quel est un bon rapport A260/A280 ?

Environ 1,8 pour l'ADN pur et environ 2,0 pour l'ARN pur. NEB indique 1,85 à 1,88 pour de l'ADN double brin propre dans le tampon, et environ 2,1 pour l'ARN. Des rapports nettement plus bas suggèrent une contamination par des protéines ou du phénol ; le pH du tampon décale aussi le rapport. Lisez-le comme un guide et non comme un test de réussite ou d'échec.

Que signifie un rapport A260/A230 bas ?

Quelque chose d'autre que l'acide nucléique absorbe à 230 nm. Les coupables habituels sont les sels de guanidine des kits à colonne, l'EDTA, les détergents, le phénol et les glucides entraînés. Refaites l'élution ou la précipitation de l'échantillon, et vérifiez que le blanc a été fait avec le même tampon que l'échantillon.

Comment convertir des ng d'ADN en pmol ?

Divisez la masse en nanogrammes par la masse moléculaire, soit environ 660 g/mol par paire de bases pour l'ADN double brin, et multipliez par 1 000. Pour 100 ng d'un plasmide de 3 000 bp : 100 × 1 000 ÷ (660 × 3 000) = 0,0505 pmol. Le convertisseur ci-dessus fait ce calcul dans les deux sens.

Le ng/µL est-il la même chose que le µg/mL ?

Oui. Un nanogramme par microlitre vaut 10⁻⁹ g par 10⁻⁶ L, soit 10⁻³ g/L ou 1 µg/mL. C'est pourquoi les facteurs de conversion A260 sont donnés dans les deux unités, soit 50 ng/µL ou 50 µg/mL par unité d'absorbance.

Pourquoi ma lecture NanoDrop diffère-t-elle d'une mesure Qubit ?

L'absorbance compte tout ce qui absorbe à 260 nm — ARN, nucléotides libres et contaminants — alors qu'un dosage par colorant fluorescent comme le Qubit se lie spécifiquement à l'ADN double brin. L'absorbance donne en général le chiffre le plus élevé sur les préparations brutes. Les deux concordent de près pour de l'ADN double brin propre et purifié.

Mon A260 est supérieure à 1,5. Puis-je quand même l'utiliser ?

Diluez l'échantillon et relisez-le. La plupart des spectrophotomètres perdent leur linéarité à forte absorbance : une lecture bien supérieure à 1,5 sous-estime donc la concentration réelle. Saisissez le facteur de dilution pour que le calculateur ramène le résultat à la solution mère.