DNA濃度計算ツール

結果

DNA濃度計算ツールの使い方

1. 1. 試料の種類を選びます。 dsDNA（プラスミド、PCR産物、ゲノムDNA）、ssDNA、RNA、短いオリゴヌクレオチドから選びます。これで換算係数が決まり、後でモル質量も決まります。
2. 2. 吸光度を入力します。 A₂₆₀ を入力します。純度比を得るには A₂₈₀ と A₂₃₀ を追加し、プロトコルで差し引く場合はバックグラウンド（A₃₂₀）を入力します。光路長と希釈倍率が 10 mm と 1 でない場合は、それぞれ設定してください。
3. 3. 任意：体積と長さを入力します。 体積を入力すると総量が µg で求まり、長さ（dsDNA は bp、それ以外は nt）を入力するとモル濃度と pmol が加わります。
4. 4. 結果を読みます。 濃度、純度の判定、計算過程がすべて一緒に表示されます。吸光度のデータがなくても量を換算したい場合は、ng ↔ pmol モードに切り替えてください。

A260から濃度を求める方法

核酸は紫外光を 260 nm で最もよく吸収します。ランベルト・ベールの法則により、吸光度は濃度に比例するので、ひとつの換算係数で吸光度から質量濃度が得られます：

係数 ε は核酸の種類によって決まります。Thermo Fisher の NanoDrop FAQ は、これらの値を ng·cm/µL で示しており、New England Biolabs の技術資料では、10 mm の光路について同じ3つの値を µg/mL で示しています：

これらは一般的な塩基組成での平均値です。短いオリゴヌクレオチドは配列によって変わるため、メーカーが示すオリゴ固有の吸光係数のほうが正確です。また、ssDNA について 37 µg/mL のように別の値を載せている文献もあります。プロトコルや試薬メーカーが別の係数を指定している場合は、上書き欄を使ってください。

純度比の読み方

タンパク質は 280 nm 付近に吸収があり、よくある夾雑物の多くは 230 nm 付近に吸収があります。そのため2つの比を見ると、試料に何が混ざっているかを手早く確認できます：

• A₂₆₀/A₂₈₀。 純粋なDNAでは約 1.8（NEB はバッファー中で 1.85〜1.88 と報告）、RNA では約 2.0〜2.1 です。低い値はタンパク質やフェノールを示し、DNA 調製物で高い値になる場合は RNA が混入している可能性があります。酸性の溶液では値が低く、塩基性の溶液では高く読まれるため、バッファーの pH を確認してください。
• A₂₆₀/A₂₃₀。 より鋭敏な指標で、清浄な試料では通常 2.0〜2.4 です。グアニジン塩、EDTA、界面活性剤、フェノール、糖質によって値は下がります。NEB は、この比は A₂₆₀/A₂₈₀ よりも変動が大きいため、注意して読むべきだと注意しています。
• 一般的な目安。 実際の作業では、両方の比が 1.8 を超えていれば、ほとんどの後続実験に使えるほど清浄とみなされます。

具体例：プラスミドのミニプレップ

5,000 bp のプラスミドを 50 µL で溶出し、1 対 10 に希釈して、10 mm のキュベットで読み取ります：A₂₆₀ = 0.412、A₂₈₀ = 0.222、A₂₃₀ = 0.18。これらは計算ツールの既定値です。

1. 濃度：0.412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL。
2. 純度：0.412 ÷ 0.222 = 1.86、0.412 ÷ 0.18 = 2.29。どちらも清浄な範囲に十分入っています。
3. 総量：206 ng/µL × 50 µL = 10.3 µg の DNA が試験管内にあります。
4. モル濃度：206 × 1,000 ÷ (660 × 5,000) = 0.06242 pmol/µL = 62.42 nM。試験管内では 3.121 pmol です。

ng と pmol の換算

クローニングやライゲーションのレシピは pmol で書かれていますが、分光光度計はナノグラムで値を出します。換算には長さと、塩基対または塩基あたりの平均分子量が必要です：

確認に使える目安：1,000 bp の断片 1 µg は 1.515 pmol（末端は 3.03 pmol）で、供給元が示す「キロ塩基あたり 1 µg あたり 1.52 pmol」という数値と同じです。塩基対あたり 660 g/mol は平均値です。650 を使う資料もあり、その場合 pmol は約 1.5% 変わります。オリゴの正確な分子量が必要な場合は、メーカーの値を使ってください。挿入断片とベクターの比をこれらの量から計画するには、Ligation Calculator を使ってください。

よくある間違い

• 希釈倍率を忘れる。 キュベットの値は希釈された試料の値なので、元の濃度に戻すには掛け直します。
• オリゴや RNA に dsDNA の係数を使う。 答えが 33〜50% 違ってきます。
• 線形範囲の外で読む。 A₂₆₀ はおよそ 0.1〜1.5 の間に保ってください。濃い試料は希釈して読み直してください。
• 吸光度で何もかも判断する。 遊離ヌクレオチド、RNA、一本鎖の断片はすべて 260 nm で吸収するため、粗精製物では吸光度が、完全な二本鎖DNAの量を実際より多く見せます。その点が重要な場合は、二本鎖DNAに特異的な蛍光色素のほうが選択性が高くなります。

よくある質問

A260 から DNA 濃度はどのように計算しますか？

吸光度に換算係数を掛け、さらに希釈倍率を掛けます。係数は二本鎖DNAで 50 ng/µL、一本鎖DNAで 33、RNA で 40 です。10 倍に希釈した二本鎖DNAの A260 が 0.412 なら、0.412 × 50 × 10 = 206 ng/µL になります。光路長が 10 mm 以外の場合は、10 を光路長（mm）で割った値を掛けてください。

A260/A280 比はどのくらいが良いですか？

純粋なDNAでは約 1.8、純粋なRNAでは約 2.0 です。NEB は、バッファー中の清浄な二本鎖DNAについて 1.85〜1.88、RNA について約 2.1 と報告しています。これらより明らかに低い比は、タンパク質やフェノールの混入を示唆します。また、比はバッファーの pH によっても変わるため、合否の判定ではなく目安として読んでください。

A260/A230 比が低いのは何を意味しますか？

核酸以外のものが 230 nm で吸収しています。よくある原因は、カラムキットに由来するグアニジン塩、EDTA、界面活性剤、フェノール、糖質の混入です。試料を再溶出または再沈殿させ、機器を試料と同じバッファーでブランクしたか確認してください。

DNA の ng を pmol に換算するにはどうしますか？

ナノグラムの質量を分子量で割り、1,000 を掛けます。二本鎖DNAでは塩基対あたり約 660 g/mol です。3,000 bp のプラスミドの 100 ng なら、100 × 1,000 ÷ (660 × 3,000) = 0.0505 pmol です。上の換算ツールは両方向に換算します。

ng/µL と µg/mL は同じですか？

同じです。1ナノグラム毎マイクロリットルは、10⁻⁹ g を 10⁻⁶ L で割ったもので、10⁻³ g/L、つまり 1 µg/mL です。そのため、A260 の換算係数は、吸光度 1 単位あたり 50 ng/µL または 50 µg/mL と、両方の単位で示されます。

NanoDrop の値が Qubit と違うのはなぜですか？

吸光度は 260 nm で吸収するもの（RNA、遊離ヌクレオチド、夾雑物）をすべて数えます。一方、Qubit のような蛍光色素アッセイは二本鎖DNAに特異的に結合します。粗精製物では通常、吸光度のほうが高い値になります。清浄に精製した二本鎖DNAなら、両者はよく一致します。

A260 が 1.5 を超えています。そのまま使えますか？

試料を希釈して読み直してください。多くの分光光度計は吸光度が高いと直線性を失うため、1.5 を大きく超える値は実際の濃度を過小評価します。希釈倍率を入力すると、計算ツールが元の原液の値に戻します。