Калькулятор концентрации ДНК

Результаты

Как пользоваться калькулятором концентрации ДНК

1. 1. Выберите тип образца. dsDNA (плазмиды, продукты ПЦР, геномная ДНК), ssDNA, РНК или короткий олигонуклеотид. Это задаёт коэффициент пересчёта и позже молекулярную массу.
2. 2. Введите показания. Введите A₂₆₀. Добавьте A₂₈₀ и A₂₃₀, чтобы получить соотношения чистоты, и фоновое показание (A₃₂₀), если ваш протокол его вычитает. Задайте длину пути и коэффициент разбавления, если они не равны 10 мм и 1.
3. 3. По желанию: добавьте объём и длину. Объём даёт общий выход в мкг; длина (п.н. для dsDNA, нт для остальных) добавляет молярность и пмоль.
4. 4. Прочитайте результат. Концентрация, оценки чистоты и полный ход вычислений появляются вместе. Переключитесь в режим нг ↔ пмоль, чтобы пересчитать количество ДНК без данных поглощения.

Как A260 превращается в концентрацию

Нуклеиновые кислоты сильнее всего поглощают ультрафиолет при 260 нм. По закону Бера — Ламберта поглощение пропорционально концентрации, поэтому один коэффициент пересчёта превращает показание в массовую концентрацию:

Коэффициент ε зависит от типа нуклеиновой кислоты. В FAQ NanoDrop компании Thermo Fisher перечислены эти значения в нг·см/мкл, а техническая заметка New England Biolabs даёт те же три величины в мкг/мл для кюветы 10 мм:

Это средние значения для типичного состава оснований. Короткие олигонуклеотиды различаются в зависимости от последовательности — точнее коэффициент экстинкции олигонуклеотида от производителя — а в некоторых справочниках для ssDNA приводится другое значение, например 37 мкг/мл. Используйте поле переопределения, если ваш протокол или поставщик указывает другой коэффициент.

Как читать соотношения чистоты

Белки поглощают около 280 нм, а многие распространённые загрязнители — около 230 нм, поэтому два соотношения дают быструю проверку того, что ещё есть в пробирке:

• A₂₆₀/A₂₈₀. Около 1,8 для чистой ДНК (NEB приводит 1,85–1,88 в буфере) и около 2,0–2,1 для РНК. Низкое значение указывает на белок или фенол; высокое значение в препарате ДНК может означать перенос РНК. Кислые растворы дают более низкие значения, а щелочные — более высокие, поэтому проверяйте pH буфера.
• A₂₆₀/A₂₃₀. Более чувствительный показатель, обычно 2,0–2,4 для чистых образцов. Соли гуанидина, EDTA, детергенты, фенол и углеводы его снижают. NEB предупреждает, что это соотношение варьирует сильнее, чем A₂₆₀/A₂₈₀, и его нужно читать осторожно.
• Общий порог. На практике оба соотношения выше 1,8 считаются достаточно чистыми для большинства дальнейших работ.

Пример: миниприп плазмиды

Плазмида 5 000 п.н. элюирована в 50 мкл, разведена 1 к 10 и измерена в кювете 10 мм: A₂₆₀ = 0,412, A₂₈₀ = 0,222, A₂₃₀ = 0,18. Это значения по умолчанию в калькуляторе.

1. Концентрация: 0,412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 нг/мкл.
2. Чистота: 0,412 ÷ 0,222 = 1,86 и 0,412 ÷ 0,18 = 2,29. Оба значения уверенно попадают в диапазон чистых образцов.
3. Выход: 206 нг/мкл × 50 мкл = 10,3 мкг ДНК в пробирке.
4. Молярность: 206 × 1 000 ÷ (660 × 5 000) = 0,06242 пмоль/мкл = 62,42 нМ, что составляет 3,121 пмоль в пробирке.

Перевод между нг и пмоль

Рецепты клонирования и лигирования написаны в пикомолях, а спектрофотометр даёт нанограммы. Пересчёт требует длины и средней молекулярной массы на пару оснований или нуклеотид:

Проверка, которую стоит знать: 1 мкг фрагмента 1 000 п.н. составляет 1,515 пмоль (3,03 пмоль концов) — то же значение 1,52 пмоль на мкг на килобазу, которое приводят поставщики. Среднее 660 г/моль на пару оснований — приближение; некоторые источники берут 650, что меняет пмоль примерно на 1,5%. Для точной молекулярной массы олигонуклеотида используйте значение производителя. Чтобы спланировать соотношение вставки и вектора по этим количествам, воспользуйтесь калькулятором лигирования.

Типичные ошибки

• Забытый коэффициент разбавления. Показание в кювете относится к разведённому образцу; умножьте на разведение, чтобы получить концентрацию исходного раствора.
• Коэффициент dsDNA для олигонуклеотида или РНК. Разница составляет 33–50% в ответе.
• Чтение вне линейного диапазона. Держите A₂₆₀ примерно между 0,1 и 1,5; концентрированные образцы разбавляйте и измеряйте снова.
• Доверие поглощению во всех случаях. Свободные нуклеотиды, РНК и одноцепочечные фрагменты тоже поглощают на 260 нм, поэтому поглощение завышает количество интактной двухцепочечной ДНК в грубом препарате. Флуоресцентные красители, специфичные к dsDNA, более избирательны, когда это важно.

Часто задаваемые вопросы

Как рассчитать концентрацию ДНК по A260?

Умножьте показание A260 на коэффициент пересчёта — 50 нг/мкл для двухцепочечной ДНК, 33 для одноцепочечной, 40 для РНК — и на коэффициент разбавления. Показание A260 0,412 для dsDNA, разведённой 1 к 10, даёт 0,412 × 50 × 10 = 206 нг/мкл. Для пути, отличного от 10 мм, умножьте на 10 и разделите на длину пути в миллиметрах.

Каково хорошее соотношение A260/A280?

Около 1,8 для чистой ДНК и около 2,0 для чистой РНК. NEB приводит 1,85–1,88 для чистой dsDNA в буфере и около 2,1 для РНК. Значения заметно ниже указывают на загрязнение белком или фенолом; соотношение также смещается при изменении pH буфера, поэтому читайте его как ориентир, а не как тест «прошёл или нет».

Что означает низкое соотношение A260/A230?

Что-то, кроме нуклеиновой кислоты, поглощает на 230 нм. Обычные виновники — соли гуанидина из наборов колонок, EDTA, детергенты, фенол и углеводы. Переэлюируйте или переосадите образец и убедитесь, что прибор обнулён тем же буфером, что и образец.

Как перевести нг ДНК в пмоль?

Разделите массу в нанограммах на молекулярную массу — около 660 г/моль на пару оснований для dsDNA — и умножьте на 1 000. Для 100 нг плазмиды 3 000 п.н.: 100 × 1 000 ÷ (660 × 3 000) = 0,0505 пмоль. Конвертер выше делает это в обоих направлениях.

Является ли нг/мкл тем же, что мкг/мл?

Да. Один нанограмм на микролитр — это 10⁻⁹ г на 10⁻⁶ л, то есть 10⁻³ г/л, или 1 мкг/мл. Поэтому коэффициенты пересчёта A260 приводятся в обоих видах: 50 нг/мкл или 50 мкг/мл на единицу поглощения.

Почему показание NanoDrop отличается от Qubit?

Поглощение учитывает всё, что поглощает на 260 нм — РНК, свободные нуклеотиды и загрязнители, — тогда как флуоресцентный анализ с красителем, например Qubit, специфично связывается с двухцепочечной ДНК. На грубых препаратах поглощение обычно даёт большее число. На чистой очищенной dsDNA оба метода дают близкие значения.

Мой A260 выше 1,5. Можно ли использовать это значение?

Разбавьте образец и измерьте снова. Большинство спектрофотометров теряют линейность при высоком поглощении, поэтому показание намного выше 1,5 занижает реальную концентрацию. Введите коэффициент разбавления, чтобы калькулятор пересчитал ответ на исходный раствор.