DNA 浓度计算器
输入分光光度计的吸光度读数,即可得到以 ng/µL 表示的浓度、总产量,以及对 A260/A280 与 A260/A230 纯度比值的通俗解读。输入长度后还会给出摩尔浓度和 pmol;第二种模式可在 ng、µg、pmol 和 fmol 之间换算任意数量。所有计算都在您的浏览器中完成,不会上传任何内容。免费,无需注册。
从每个读数中扣除,以校正浊度或漂移的基线。
标准比色皿为 10 mm;NanoDrop 报告的是等效的 10 mm 值。
原液直接读数则为 1;若按 1:10 稀释则为 10。
用于计算总产量。
可加算摩尔浓度和 pmol。
每个 A260 单位对应的 ng·cm/µL。留空则使用 50。
结果
206
浓度 (ng/µL)
10.3
总产量 (µg)
62.42
摩尔浓度 (nM)
3.121
样品中的总量 (pmol)
1 ng/µL 即 1 µg/mL。 比色皿中的 20.6 ng/µL,稀释倍数之前
纯度比值
A260/A280 = 1.86
纯净 DNA 约为 1.8(缓冲液中为 1.85–1.88)。
在通常范围之内。
A260/A230 = 2.29
纯净样品高于 1.8,通常为 2.0–2.4。
在通常范围之内。
计算过程
c = A260 × 系数 × (10 mm ÷ 光程) × 稀释倍数
c = 0.412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL
pmol/µL = 206 × 1,000 ÷ (660 × 5,000) = 0.06242
如何使用 DNA 浓度计算器
- 1. 选择样品类型。 双链 DNA(质粒、PCR 产物、基因组 DNA)、单链 DNA、RNA 或短的寡核苷酸。这决定换算系数,以及之后使用的分子量。
- 2. 输入读数。 输入 A₂₆₀。添加 A₂₈₀ 和 A₂₃₀ 可得到纯度比值;如果您的方案需要扣除背景,还可输入背景读数 (A₃₂₀)。若光程和稀释倍数不是 10 mm 和 1,请加以设置。
- 3. 可选:添加体积和长度。 体积可得到以 µg 为单位的总产量;长度(dsDNA 为 bp,其他为 nt)可加算摩尔浓度和 pmol。
- 4. 读取结果。 浓度、纯度判断和完整的计算过程会同时显示。切换到 ng ↔ pmol 模式,即可在没有吸光度数据的情况下换算 DNA 的数量。
A260 如何换算为浓度
核酸在 260 nm 处的紫外光吸收最强。根据比尔–朗伯定律,吸光度与浓度成正比,因此一个换算系数即可把读数换算为质量浓度:
浓度
c (ng/µL) = A₂₆₀ × ε × (10 mm ÷ 光程) × 稀释倍数
说明
1 ng/µL = 1 µg/mL
系数 ε 取决于核酸的类型。Thermo Fisher 的 NanoDrop 常见问题 以 ng·cm/µL 列出了这些数值,New England Biolabs 的一份技术说明则以 10 mm 光程下的 µg/mL 给出了相同的三个数值:
| 样品 | 系数 (ng·cm/µL) | A₂₆₀ 为 1.0 时表示 |
|---|---|---|
| 双链 DNA | 50 | 50 ng/µL |
| 单链 DNA 与寡核苷酸 | 33 | 33 ng/µL |
| RNA | 40 | 40 ng/µL |
这些是典型碱基组成下的平均值。短寡核苷酸的系数随序列而异,厂商给出的寡核苷酸自身消光系数更为准确;而某些参考文献对单链 DNA 给出的数值不同,例如 37 µg/mL。如果您的方案或供应商规定了其他系数,请使用覆盖值输入框。
读懂纯度比值
蛋白质在 280 nm 附近吸收,许多常见的污染物在 230 nm 附近吸收,因此两个比值可以快速检查试管中还有什么其他物质:
- A₂₆₀/A₂₈₀。 纯净 DNA 约为 1.8(NEB 报告缓冲液中为 1.85–1.88),纯净 RNA 约为 2.0–2.1。数值偏低说明可能有蛋白质或酚;DNA 制备物中数值偏高则可能是 RNA 残留。酸性溶液读数偏低,碱性溶液读数偏高,因此请检查缓冲液的 pH。
- A₂₆₀/A₂₃₀。 这是更敏感的指标,纯净样品通常为 2.0–2.4。胍盐、EDTA、去污剂、酚和碳水化合物都会使其降低。NEB 提醒,这一比值的波动比 A₂₆₀/A₂₈₀ 更大,解读时应格外谨慎。
- 常用的阈值。 在日常实践中,两个比值都高于 1.8,通常就足以满足大多数下游实验的要求。
用相同的缓冲液做空白对照
用水做空白对照,再测量溶解在 TE 或洗脱缓冲液中的样品,会使 A₂₆₀/A₂₃₀ 偏低,因为缓冲液本身在 230 nm 处有吸收。请务必使用 DNA 所在的同一种缓冲液做空白对照。浓度低于约 20 ng/µL 时纯度比值同样不可靠,因此稀释样品应只根据其浓度来判断。
示例:质粒小量提取
一个 5,000 bp 的质粒被洗脱于 50 µL 中,稀释 10 倍后在 10 mm 比色皿中读数:A₂₆₀ = 0.412,A₂₈₀ = 0.222,A₂₃₀ = 0.18。这些是计算器的默认输入值。
- 浓度:0.412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL。
- 纯度:0.412 ÷ 0.222 = 1.86,0.412 ÷ 0.18 = 2.29。两者都处于纯净范围之内。
- 产量:206 ng/µL × 50 µL = 试管中共 10.3 µg 的 DNA。
- 摩尔浓度:206 × 1,000 ÷ (660 × 5,000) = 0.06242 pmol/µL = 62.42 nM,即试管中共 3.121 pmol。
ng 与 pmol 之间的换算
连接与克隆的配方以皮摩尔 (pmol) 为单位书写,但分光光度计给出的是纳克 (ng)。换算需要知道长度,以及每个碱基对或核苷酸的平均分子量:
双链 DNA
pmol = ng × 1,000 ÷ (660 × bp)
单链 DNA、寡核苷酸
pmol = ng × 1,000 ÷ (330 × nt)
RNA
pmol = ng × 1,000 ÷ (340 × nt)
一个常用的检验:1 µg 的 1,000 bp 片段为 1.515 pmol(末端为 3.03 pmol),与供应商引用的“每 µg 每千碱基 1.52 pmol”数值一致。每个碱基对 660 g/mol 只是平均值;有些资料使用 650,这会使 pmol 数值相差约 1.5%。若需要寡核苷酸的精确分子量,请改用厂商提供的数值。若要根据这些数量规划插入片段与载体的比例,请使用 连接计算器。
常见错误
- 忘记稀释倍数。 比色皿中的数值是稀释后的样品;需要乘回去才能得到原液的浓度。
- 对寡核苷酸或 RNA 使用双链 DNA 的系数。 两者在结果上相差 33–50%。
- 在线性范围之外读数。 请将 A₂₆₀ 保持在约 0.1 至 1.5 之间;浓缩样品应稀释后重新读数。
- 对所有样品都只相信吸光度。 游离核苷酸、RNA 和单链片段都会在 260 nm 处吸收,因此在粗制备物中,吸光度会高估完整双链 DNA 的量。若这一点很重要,可使用对双链 DNA 具有特异性的荧光染料,其选择性更好。
常见问题
- 如何根据 A260 计算 DNA 浓度?
- 将 A260 读数乘以换算系数——双链 DNA 为 50 ng/µL,单链 DNA 为 33,RNA 为 40——再乘以稀释倍数。双链 DNA 的 A260 为 0.412 并稀释 10 倍,则得到 0.412 × 50 × 10 = 206 ng/µL。光程不是 10 mm 时,按 10 除以以毫米为单位的光程进行换算。
- 什么样的 A260/A280 比值算好?
- 纯 DNA 约为 1.8,纯 RNA 约为 2.0。NEB 报告缓冲液中纯净双链 DNA 为 1.85–1.88,RNA 约为 2.1。明显低于这些数值的比值提示有蛋白质或酚的污染;该比值也会因缓冲液的 pH 而偏移,因此应把它当作参考,而不是判定合格与否的标准。
- A260/A230 比值偏低意味着什么?
- 有非核酸物质在 230 nm 处吸收。常见的原因包括柱式试剂盒中残留的胍盐、EDTA、去污剂、酚和碳水化合物。请重新洗脱或重新沉淀样品,并确保仪器是用与样品相同的缓冲液做的空白对照。
- 如何把 DNA 的 ng 换算为 pmol?
- 用质量(纳克)除以分子量,双链 DNA 每个碱基对约为 660 g/mol,再乘以 1,000。对于 3,000 bp 质粒的 100 ng:100 × 1,000 ÷ (660 × 3,000) = 0.0505 pmol。上面的换算器可以双向完成这一换算。
- ng/µL 与 µg/mL 相同吗?
- 相同。每微升一纳克即 10−9 g 每 10−6 L,也就是 10−3 g/L 或 1 µg/mL。因此 A260 换算系数既可以写作 50 ng/µL,也可以写作每吸光度单位 50 µg/mL。
- 为什么我的 NanoDrop 读数与 Qubit 不同?
- 吸光度会计入所有在 260 nm 处吸收的物质,包括 RNA、游离核苷酸和污染物,而 Qubit 等荧光染料法则专门与双链 DNA 结合。在粗制备物中,吸光度通常是更高的数值。对于纯净、纯化的双链 DNA,两者结果非常接近。
- 我的 A260 高于 1.5,还能使用吗?
- 请稀释样品后重新读数。大多数分光光度计在高吸光度时会失去线性,因此远高于 1.5 的读数会低估实际浓度。请输入稀释倍数,使计算器把结果换算回原液。