DNA सांद्रता कैलकुलेटर

परिणाम

DNA सांद्रता कैलकुलेटर का उपयोग कैसे करें

1. 1. नमूने का प्रकार चुनें। dsDNA (प्लाज़्मिड, PCR उत्पाद, जीनोमिक DNA), ssDNA, RNA या छोटा ओलिगोन्यूक्लियोटाइड। इससे रूपांतरण गुणांक तय होता है और बाद में आणविक भार भी।
2. 2. पाठ दर्ज करें। A₂₆₀ लिखें। शुद्धता अनुपात पाने के लिए A₂₈₀ और A₂₃₀ जोड़ें, और अगर आपका प्रोटोकॉल पृष्ठभूमि घटाता है तो बैकग्राउंड पाठ (A₃₂₀) भी। पथ-लंबाई और तनुकरण गुणक 10 mm और 1 न हों तो उन्हें सेट करें।
3. 3. वैकल्पिक: आयतन और लंबाई जोड़ें। आयतन से µg में कुल उपज मिलती है; लंबाई (dsDNA के लिए bp, बाकी के लिए nt) मोलरता और pmol जोड़ती है।
4. 4. परिणाम पढ़ें। सांद्रता, शुद्धता के निर्णय और पूरी प्रक्रिया एक साथ दिखते हैं। बिना अवशोषण डेटा के DNA की मात्रा बदलने के लिए ng ↔ pmol मोड पर जाएँ।

A260 सांद्रता कैसे बनता है

न्यूक्लिक अम्ल 260 nm पर पराबैंगनी प्रकाश को सबसे अधिक अवशोषित करते हैं। बीयर–लैम्बर्ट नियम के अनुसार अवशोषण सांद्रता के समानुपाती है, इसलिए एक रूपांतरण गुणांक पाठ को द्रव्यमान सांद्रता में बदल देता है:

गुणांक ε न्यूक्लिक अम्ल के प्रकार पर निर्भर है। Thermo Fisher का NanoDrop FAQ ये मान ng·cm/µL में सूचीबद्ध करता है, और New England Biolabs की एक तकनीकी टिप्पणी 10 mm पथ के लिए वही तीन मान µg/mL में देती है:

ये एक सामान्य बेस संरचना के औसत मान हैं। छोटे ओलिगोन्यूक्लियोटाइड अपने अनुक्रम के साथ बदलते हैं — निर्माता का अपना विलोपन गुणांक अधिक सटीक है — और कुछ संदर्भ ssDNA के लिए अलग मान देते हैं, जैसे 37 µg/mL। यदि आपका प्रोटोकॉल या आपूर्तिकर्ता कोई और गुणांक तय करता है, तो ओवरराइड फ़ील्ड का उपयोग करें।

शुद्धता अनुपात पढ़ना

प्रोटीन 280 nm के आसपास अवशोषित करते हैं और कई सामान्य संदूषक 230 nm के आसपास, इसलिए दो अनुपात नली में और क्या है, इसकी त्वरित जाँच देते हैं:

• A₂₆₀/A₂₈₀. साफ़ DNA के लिए लगभग 1.8 (NEB बफ़र में 1.85–1.88 बताता है) और RNA के लिए लगभग 2.0–2.1। कम मान प्रोटीन या फ़ीनॉल की ओर इशारा करता है; DNA तैयारी में ऊँचा मान RNA के बचे रह जाने से हो सकता है। अम्लीय विलयन कम और क्षारीय अधिक पढ़े जाते हैं, इसलिए बफ़र का pH जाँचें।
• A₂₆₀/A₂₃₀. अधिक संवेदनशील संकेतक, साफ़ नमूनों के लिए आम तौर पर 2.0–2.4। ग्वानिडीन लवण, EDTA, डिटर्जेंट, फ़ीनॉल और कार्बोहाइड्रेट इसे कम करते हैं। NEB चेतावनी देता है कि यह अनुपात A₂₆₀/A₂₈₀ से अधिक बदलता है और इसे सावधानी से पढ़ना चाहिए।
• सामान्य सीमा। व्यवहार में, दोनों अनुपात 1.8 से ऊपर होने पर अधिकांश आगे के काम के लिए पर्याप्त साफ़ माने जाते हैं।

हल किया गया उदाहरण: एक प्लाज़्मिड मिनीप्रेप

5,000 bp का एक प्लाज़्मिड 50 µL में इल्यूट किया गया है, 1 में 10 तनुकृत किया गया और 10 mm क्यूवेट में पढ़ा गया: A₂₆₀ = 0.412, A₂₈₀ = 0.222, A₂₃₀ = 0.18। ये कैलकुलेटर के डिफ़ॉल्ट इनपुट हैं।

1. सांद्रता: 0.412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL।
2. शुद्धता: 0.412 ÷ 0.222 = 1.86 और 0.412 ÷ 0.18 = 2.29। दोनों साफ़ सीमा में आराम से हैं।
3. उपज: 206 ng/µL × 50 µL = नली में 10.3 µg DNA।
4. मोलरता: 206 × 1,000 ÷ (660 × 5,000) = 0.06242 pmol/µL = 62.42 nM, जो नली में 3.121 pmol है।

ng और pmol के बीच बदलना

क्लोनिंग और लाइगेशन की विधियाँ पिकोमोल में लिखी जाती हैं, लेकिन स्पेक्ट्रोफ़ोटोमीटर नैनोग्राम देता है। रूपांतरण के लिए लंबाई और प्रति आधार-युग्म या न्यूक्लियोटाइड का औसत आणविक भार चाहिए:

परिचित जाँच: 1,000 bp के टुकड़े का 1 µg 1.515 pmol है (सिरों के 3.03 pmol), वही 1.52 pmol प्रति µg प्रति किलोबेस का आँकड़ा जो आपूर्तिकर्ता बताते हैं। प्रति आधार-युग्म 660 g/mol एक औसत है; कुछ स्रोत 650 उपयोग करते हैं, जो pmol को लगभग 1.5% बदलता है। ओलिगो का सटीक आणविक भार चाहिए तो निर्माता का मान लें। इन मात्राओं से insert-से-vector अनुपात की योजना बनाने के लिए लाइगेशन कैलकुलेटर देखें।

सामान्य गलतियाँ

• तनुकरण गुणक भूल जाना। क्यूवेट का मान तनुकृत नमूने का है; स्टॉक पाने के लिए वापस गुणा करें।
• ओलिगो या RNA के लिए dsDNA गुणांक लगाना। इससे उत्तर में 33–50% का अंतर आ जाता है।
• रैखिक सीमा से बाहर पढ़ना। A₂₆₀ को लगभग 0.1 और 1.5 के बीच रखें; सांद्र नमूने तनुकृत करके फिर पढ़ें।
• हर चीज़ के लिए अवशोषण पर भरोसा करना। मुक्त न्यूक्लियोटाइड, RNA और एकल-स्ट्रैंडेड टुकड़े सभी 260 nm पर अवशोषित करते हैं, इसलिए कच्ची तैयारी में अवशोषण अखंड dsDNA की मात्रा को अधिक बताता है। जब यह मायने रखे, तो dsDNA-विशिष्ट फ़्लोरोसेंट डाई अधिक चयनात्मक होते हैं।

अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न

A260 से DNA सांद्रता कैसे निकालें?

A260 पाठ को रूपांतरण गुणांक से गुणा करें: dsDNA के लिए 50 ng/µL, ssDNA के लिए 33, RNA के लिए 40, और किसी भी तनुकरण गुणक से भी। 10 गुना तनुकृत dsDNA के लिए A260 0.412 देता है 0.412 × 50 × 10 = 206 ng/µL। 10 mm से अलग पथ के लिए, 10 को मिलीमीटर में पथ-लंबाई से भाग दें और उससे गुणा करें।

अच्छा A260/A280 अनुपात क्या है?

शुद्ध DNA के लिए लगभग 1.8 और शुद्ध RNA के लिए लगभग 2.0। NEB बफ़र में साफ़ dsDNA के लिए 1.85–1.88 और RNA के लिए लगभग 2.1 बताता है। इन मानों से स्पष्ट रूप से कम मान प्रोटीन या फ़ीनॉल संदूषण का संकेत है; यह अनुपात बफ़र के pH से भी खिसकता है, इसलिए इसे मार्गदर्शक मानें, पास-या-फ़ेल परीक्षा नहीं।

कम A260/A230 अनुपात का क्या अर्थ है?

न्यूक्लिक अम्ल के अलावा कुछ और 230 nm पर अवशोषित कर रहा है। आम कारण हैं कॉलम किट से ग्वानिडीन लवण, EDTA, डिटर्जेंट, फ़ीनॉल और कार्बोहाइड्रेट का बचा रह जाना। नमूने को फिर से इल्यूट या अवक्षेपित करें, और सुनिश्चित करें कि उपकरण नमूने के समान बफ़र से ब्लैंक किया गया था।

DNA के ng को pmol में कैसे बदलें?

नैनोग्राम में द्रव्यमान को आणविक भार से भाग दें, जो dsDNA के लिए प्रति आधार-युग्म लगभग 660 g/mol है, और 1,000 से गुणा करें। 3,000 bp प्लाज़्मिड के 100 ng के लिए: 100 × 1,000 ÷ (660 × 3,000) = 0.0505 pmol। ऊपर का कन्वर्टर दोनों दिशाओं में यह करता है।

क्या ng/µL और µg/mL एक ही हैं?

हाँ। एक नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर 10⁻⁹ g प्रति 10⁻⁶ L है, जो 10⁻³ g/L या 1 µg/mL है। इसीलिए A260 रूपांतरण गुणांक दोनों तरह लिखे जाते हैं: प्रति अवशोषण इकाई 50 ng/µL या 50 µg/mL।

मेरा NanoDrop पाठ Qubit से अलग क्यों है?

अवशोषण 260 nm पर अवशोषित होने वाली हर चीज़ गिनता है — RNA, मुक्त न्यूक्लियोटाइड और संदूषक — जबकि Qubit जैसी फ़्लोरोसेंट डाई परख dsDNA से विशेष रूप से जुड़ती है। कच्ची तैयारी पर अवशोषण आम तौर पर ऊँची संख्या होती है। साफ़, शुद्ध dsDNA पर दोनों लगभग एक जैसे आते हैं।

मेरा A260 1.5 से ऊपर है। क्या मैं फिर भी उसका उपयोग कर सकता हूँ?

नमूना तनुकृत करें और फिर से पढ़ें। अधिकांश स्पेक्ट्रोफ़ोटोमीटर ऊँचे अवशोषण पर रैखिकता खो देते हैं, इसलिए 1.5 से बहुत ऊपर का पाठ असली सांद्रता को कम आँकता है। तनुकरण गुणक दर्ज करें ताकि कैलकुलेटर उत्तर को स्टॉक तक वापस ले जाए।