حاسبة تركيز الحمض النووي

النتائج

كيفية استخدام حاسبة تركيز الحمض النووي

1. 1. اختر نوع العينة. dsDNA (البلازميدات ونواتج PCR والحمض النووي الجيني)، أو ssDNA، أو RNA، أو أوليغونوكليوتيد قصير. وهذا يحدد عامل التحويل، وفيما بعد الوزن الجزيئي.
2. 2. أدخل القراءات. اكتب A₂₆₀. أضف A₂₈₀ وA₂₃₀ للحصول على نسب النقاء، وقراءة الخلفية A₃₂₀ إذا كان بروتوكولك يطرحها. واضبط طول المسار وعامل التخفيف إذا لم يكونا 10 ملم و1.
3. 3. اختياري: أضف الحجم والطول. يعطي الحجم الكمية الكلية بوحدة µg؛ ويضيف الطول (bp لـ dsDNA، وإلا nt) التركيز المولي وpmol.
4. 4. اقرأ النتيجة. يظهر التركيز وأحكام النقاء والحل الكامل معًا. بدّل إلى وضع ng ↔ pmol لتحويل كمية من الحمض النووي دون أي بيانات امتصاص.

كيف يتحول A260 إلى تركيز

تمتص الأحماض النووية الضوء فوق البنفسجي بأقوى صورة عند 260 نانومتر. وبحسب قانون بير–لامبرت يتناسب الامتصاص مع التركيز، لذا يحوّل عامل تحويل واحد القراءة إلى تركيز كتلي:

العامل ε خاص بنوع الحمض النووي. يسرد NanoDrop FAQ من Thermo Fisher هذه القيم، بوحدة ng·cm/µL، كما تذكر ملاحظة تقنية من New England Biolabs القيم الثلاث نفسها بوحدة µg/mL لمسار 10 ملم:

هذه متوسطات لتركيب قاعدي نموذجي. تتفاوت الأوليغونوكليوتيدات القصيرة بحسب تسلسلها، والأدق هو معامل الانقراض الخاص بالأوليغو من الشركة المصنِّعة. وبعض المراجع تذكر قيمة مختلفة لـ ssDNA، مثل 37 µg/mL. استخدم حقل التعديل إذا حدّد بروتوكولك أو مورّدك عاملًا آخر.

قراءة نسب النقاء

تمتص البروتينات قرب 280 نانومتر، وتمتص كثير من الملوثات الشائعة قرب 230 نانومتر، لذا تعطي النسبتان فحصًا سريعًا لما يوجد أيضًا في الأنبوب:

• A₂₆₀/A₂₈₀. حوالي 1.8 للحمض النووي النقي (تذكر NEB القيم 1.85–1.88 في المحلول المنظم)، وحوالي 2.0–2.1 للـ RNA. والقيمة المنخفضة تشير إلى البروتين أو الفينول؛ والقيمة المرتفعة في تحضير DNA قد تعني بقايا RNA. تقرأ المحاليل الحمضية قيمًا أقل والقلوية أعلى، لذا تحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول المنظم.
• A₂₆₀/A₂₃₀. مؤشر أكثر حساسية، وغالبًا ما يكون 2.0–2.4 للعينات النظيفة. وأملاح الغوانيدين وEDTA والمنظفات والفينول والكربوهيدرات تخفضه. وتنبه NEB إلى أن هذه النسبة تتفاوت أكثر من A₂₆₀/A₂₈₀ ويجب قراءتها بعناية.
• العتبة الشائعة. في الممارسة اليومية تُعد النسبتان فوق 1.8 نظيفتين بما يكفي لمعظم الاستخدامات اللاحقة.

مثال تطبيقي: تحضير بلازميد مصغّر

يُستخلص بلازميد طوله 5,000 bp في 50 µL، ويُخفَّف 1 في 10 ويُقرأ في الكوفيت بمسار 10 ملم: A₂₆₀ = 0.412، وA₂₈₀ = 0.222، وA₂₃₀ = 0.18. هذه هي القيم الافتراضية للحاسبة.

1. التركيز: 0.412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL.
2. النقاء: 0.412 ÷ 0.222 = 1.86 و0.412 ÷ 0.18 = 2.29. كلاهما يقع بارتياح في النطاق النظيف.
3. الكمية الكلية: 206 ng/µL × 50 µL = 10.3 µg من الحمض النووي في الأنبوب.
4. التركيز المولي: 206 × 1,000 ÷ (660 × 5,000) = 0.06242 pmol/µL = 62.42 nM، أي 3.121 pmol في الأنبوب.

التحويل بين ng وpmol

تُكتب وصفات الاستنساخ والربط بالبيكومول، لكن مقياس الطيف يعطي نانوغرامات. ويحتاج التحويل إلى الطول ومتوسط الوزن الجزيئي لكل زوج قواعد أو نيوكليوتيد:

والحساب المألوف: 1 µg من قطعة طولها 1,000 bp يساوي 1.515 pmol (3.03 pmol من الأطراف)، وهو الرقم نفسه 1.52 pmol لكل µg لكل كيلوقاعدة الذي تذكره الموردون. والوزن 660 g/mol لكل زوج قواعد متوسط؛ وبعض المصادر تستخدم 650، وهذا يغيّر pmol بحوالي 1.5%. وللوزن الجزيئي الدقيق للأوليغو استخدم القيمة التي تعطيها الشركة المصنِّعة. ولتخطيط نسبة الإدخال إلى المتجه من هذه الكميات، استخدم حاسبة الربط.

أخطاء شائعة

• نسيان عامل التخفيف. قيمة الكوفيت تخص العينة المخففة؛ اضرب في عامل التخفيف للوصول إلى المحلول الأصلي.
• استخدام عامل dsDNA لأوليغو أو RNA. الفرق يبلغ 33–50% في الناتج.
• القراءة خارج المدى الخطي. أبقِ A₂₆₀ بين حوالي 0.1 و1.5؛ خفّف العينات المركزة واقرأ من جديد.
• الثقة بالامتصاص في كل شيء. النيوكليوتيدات الحرة وRNA والأجزاء مفردة الشريط تمتص كلها عند 260 نانومتر، فيبالغ الامتصاص في تقدير كمية الحمض النووي المزدوج السليم في التحضير الخام. وأصباغ الفلورة الخاصة بـ dsDNA أدق عندما يهم ذلك.

الأسئلة الشائعة

كيف أحسب تركيز الحمض النووي من A260؟

اضرب قراءة A260 في عامل التحويل — 50 ng/µL لـ dsDNA، و33 لـ ssDNA، و40 لـ RNA — وفي أي عامل تخفيف. فقراءة A260 تساوي 0.412 لـ dsDNA مخففًا 1 في 10 تعطي 0.412 × 50 × 10 = 206 ng/µL. ولمسار غير 10 ملم، اضرب في 10 مقسومًا على طول المسار بالملليمتر.

ما هي نسبة A260/A280 الجيدة؟

حوالي 1.8 للحمض النووي النقي، وحوالي 2.0 للـ RNA النقي. تذكر NEB القيم 1.85–1.88 لـ dsDNA النظيف في المحلول المنظم، وحوالي 2.1 للـ RNA. والنسب الأدنى بوضوح من هذه تشير إلى تلوث بالبروتين أو الفينول؛ كما يتأثر الرقم برقم الحموضة للمحلول المنظم، فاعتبره دليلًا إرشاديًا لا اختبار نجاح أو رسوب.

ماذا تعني نسبة A260/A230 المنخفضة؟

شيء غير الحمض النووي يمتص عند 230 نانومتر. والمسببات المعتادة هي أملاح الغوانيدين من أطقم الاستخلاص، وEDTA، والمنظفات، والفينول، وبقايا الكربوهيدرات. أعِد استخلاص العينة أو ترسيبها، وتأكد من أن الجهاز ضُبط بالمحلول المنظم نفسه الذي توجد فيه العينة.

كيف أحوّل ng من الحمض النووي إلى pmol؟

اقسم الكتلة بالنانوغرام على الوزن الجزيئي، وهو حوالي 660 g/mol لكل زوج قواعد لـ dsDNA، ثم اضرب في 1,000. لـ 100 ng من بلازميد طوله 3,000 bp: 100 × 1,000 ÷ (660 × 3,000) = 0.0505 pmol. والحاسبة أعلاه تفعل ذلك في الاتجاهين.

هل ng/µL هو نفسه µg/mL؟

نعم. النانوغرام لكل ميكرولتر هو 10⁻⁹ غرام لكل 10⁻⁶ لتر، أي 10⁻³ غرام لكل لتر، أو 1 µg/mL. لهذا تُذكر عوامل تحويل A260 بالصيغتين، مثل 50 ng/µL أو 50 µg/mL لكل وحدة امتصاص.

لماذا تختلف قراءة NanoDrop الخاصة بي عن Qubit؟

الامتصاص يحسب أي شيء يمتص عند 260 نانومتر — RNA والنيوكليوتيدات الحرة والملوثات — بينما يرتبط اختبار صبغ الفلورة مثل Qubit بالحمض النووي مزدوج الشريطين تحديدًا. والامتصاص عادةً هو الرقم الأعلى في التحضيرات الخام. ويتفقان تقريبًا في الحمض النووي المزدوج النظيف والمنقى.

قراءة A260 تتجاوز 1.5. هل يمكنني استخدامها؟

خفّف العينة واقرأ من جديد. تفقد معظم أجهزة قياس الطيف خطيتها عند الامتصاص المرتفع، لذا القراءة التي تتجاوز 1.5 بكثير تقلل التركيز الحقيقي. أدخل عامل التخفيف حتى تعيد الحاسبة النتيجة إلى المحلول الأصلي.