Kalkulator stężenia DNA

Wyniki

Jak korzystać z kalkulatora stężenia DNA

1. 1. Wybierz rodzaj próbki. dsDNA (plazmidy, produkty PCR, DNA genomowe), ssDNA, RNA albo krótki oligonukleotyd. To ustawia współczynnik przeliczeniowy i później masę cząsteczkową.
2. 2. Wpisz odczyty. Wpisz A₂₆₀. Dodaj A₂₈₀ i A₂₃₀, aby otrzymać wskaźniki czystości, oraz odczyt tła A₃₂₀, jeśli Twój protokół go odejmuje. Ustaw długość drogi optycznej i współczynnik rozcieńczenia, jeśli nie są to 10 mm i 1.
3. 3. Opcjonalnie: dodaj objętość i długość. Objętość daje całkowitą wydajność w µg; długość (pz dla dsDNA, nt w pozostałych przypadkach) dodaje molowość i pmol.
4. 4. Odczytaj wynik. Stężenie, oceny czystości i pełne obliczenia pojawiają się razem. Przełącz na tryb ng ↔ pmol, aby przeliczyć ilość DNA bez danych absorbancji.

Jak A260 staje się stężeniem

Kwasy nukleinowe najsilniej pochłaniają światło ultrafioletowe przy 260 nm. Według prawa Beera–Lamberta absorbancja jest proporcjonalna do stężenia, więc jeden współczynnik przelicza odczyt na stężenie masowe:

Współczynnik ε zależy od rodzaju kwasu nukleinowego. FAQ NanoDrop firmy Thermo Fisher podaje te wartości w ng·cm/µL, a nota techniczna firmy New England Biolabs podaje te same trzy wartości jako µg/mL dla drogi 10 mm:

To średnie wartości dla typowego składu zasad. Krótkie oligonukleotydy różnią się zależnie od sekwencji — współczynnik ekstynkcji oligo podany przez producenta jest dokładniejszy — a niektóre źródła podają inną wartość dla ssDNA, na przykład 37 µg/mL. Użyj pola nadpisania, jeśli Twój protokół lub dostawca podaje inny współczynnik.

Odczytywanie wskaźników czystości

Białka pochłaniają w pobliżu 280 nm, a wiele typowych zanieczyszczeń w pobliżu 230 nm, więc dwa wskaźniki dają szybki obraz tego, co jeszcze znajduje się w probówce:

• A₂₆₀/A₂₈₀. Około 1,8 dla czystego DNA (NEB podaje 1,85–1,88 w buforze) i około 2,0–2,1 dla RNA. Niska wartość wskazuje na białko lub fenol; wysoka wartość w preparacie DNA może oznaczać przeniesiony RNA. Kwaśne roztwory dają niższe odczyty, a zasadowe wyższe, więc sprawdź pH buforu.
• A₂₆₀/A₂₃₀. Czulszy wskaźnik, zwykle 2,0–2,4 dla czystych próbek. Sole guanidyny, EDTA, detergenty, fenol i węglowodany go obniżają. NEB ostrzega, że ten wskaźnik zmienia się bardziej niż A₂₆₀/A₂₈₀ i trzeba go odczytywać ostrożnie.
• Wspólny próg. W codziennej praktyce oba wskaźniki powyżej 1,8 uznaje się za wystarczająco czyste dla większości dalszych zastosowań.

Przykład krok po kroku: miniprep plazmidu

Plazmid o długości 5 000 pz jest eluowany w 50 µL, rozcieńczony 1 do 10 i odczytany w kuwecie 10 mm: A₂₆₀ = 0,412, A₂₈₀ = 0,222, A₂₃₀ = 0,18. To domyślne dane wejściowe kalkulatora.

1. Stężenie: 0,412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL.
2. Czystość: 0,412 ÷ 0,222 = 1,86 oraz 0,412 ÷ 0,18 = 2,29. Oba mieszczą się w zakresie czystego preparatu.
3. Wydajność: 206 ng/µL × 50 µL = 10,3 µg DNA w probówce.
4. Molowość: 206 × 1 000 ÷ (660 × 5 000) = 0,06242 pmol/µL = 62,42 nM, czyli 3,121 pmol w probówce.

Przeliczanie ng na pmol

Przepisy na klonowanie i ligację podają ilości w pikomolach, ale spektrofotometr daje nanogramy. Przeliczenie wymaga długości i średniej masy cząsteczkowej na parę zasad lub nukleotyd:

Znany sprawdzian: 1 µg fragmentu o długości 1000 pz to 1,515 pmol (3,03 pmol końców), co zgadza się z wartością 1,52 pmol na µg na kilobazę, którą podają dostawcy. Wartość 660 g/mol na parę zasad jest średnią; niektóre źródła używają 650, co zmienia pmol o około 1,5%. Dla dokładnej masy cząsteczkowej oligonukleotydu użyj wartości podanej przez producenta. Aby zaplanować stosunek wstawki do wektora na podstawie tych ilości, użyj Kalkulatora ligacji.

Częste błędy

• Zapomnienie o współczynniku rozcieńczenia. Wartość w kuwecie dotyczy próbki rozcieńczonej; pomnóż z powrotem, aby otrzymać stężenie roztworu wyjściowego.
• Użycie współczynnika dla dsDNA do oligo lub RNA. Różnica wynosi 33–50% w wyniku.
• Odczyt poza zakresem liniowym. Trzymaj A₂₆₀ w przybliżeniu między 0,1 a 1,5; silnie stężone próbki rozcieńcz i odczytaj ponownie.
• Ufanie absorbancji we wszystkim. Wolne nukleotydy, RNA i jednoniciowe fragmenty też pochłaniają przy 260 nm, więc absorbancja zawyża ilość nienaruszonego DNA dwuniciowego w surowym preparacie. Gdy to ma znaczenie, bardziej selektywne są barwniki fluorescencyjne specyficzne dla dsDNA.

Najczęstsze pytania

Jak obliczyć stężenie DNA z A260?

Pomnóż odczyt A260 przez współczynnik przeliczeniowy — 50 ng/µL dla DNA dwuniciowego, 33 dla DNA jednoniciowego, 40 dla RNA — i przez współczynnik rozcieńczenia. A260 równe 0,412 dla dsDNA rozcieńczonego 1 do 10 daje 0,412 × 50 × 10 = 206 ng/µL. Dla drogi innej niż 10 mm przeskaluj wynik, dzieląc 10 przez długość drogi w milimetrach.

Jaki jest dobry wskaźnik A260/A280?

Około 1,8 dla czystego DNA i około 2,0 dla czystego RNA. NEB podaje 1,85–1,88 dla czystego dsDNA w buforze i około 2,1 dla RNA. Wartości wyraźnie niższe sugerują zanieczyszczenie białkiem lub fenolem; na wskaźnik wpływa też pH buforu, więc traktuj go jako wskazówkę, a nie test zaliczony lub niezaliczony.

Co oznacza niski wskaźnik A260/A230?

Coś innego niż kwas nukleinowy pochłania przy 230 nm. Typowe winowajcy to sole guanidyny z zestawów kolumnowych, EDTA, detergenty, fenol i przeniesione węglowodany. Ponownie wyelucuj lub strąć próbkę i upewnij się, że przyrząd został wyzerowany tym samym buforem co próbka.

Jak przeliczyć ng DNA na pmol?

Podziel masę w nanogramach przez masę cząsteczkową, czyli około 660 g/mol na parę zasad dla dsDNA, i pomnóż przez 1 000. Dla 100 ng plazmidu o długości 3000 pz: 100 × 1 000 ÷ (660 × 3 000) = 0,0505 pmol. Powyższy przelicznik robi to w obu kierunkach.

Czy ng/µL to to samo co µg/mL?

Tak. Jeden nanogram na mikrolitr to 10⁻⁹ g na 10⁻⁶ L, czyli 10⁻³ g/L albo 1 µg/mL. Dlatego współczynniki przeliczeniowe A260 podaje się w obu zapisach: jako 50 ng/µL lub 50 µg/mL na jednostkę absorbancji.

Dlaczego mój odczyt NanoDrop różni się od Qubita?

Absorbancja liczy wszystko, co pochłania przy 260 nm — RNA, wolne nukleotydy i zanieczyszczenia — podczas gdy test barwnikiem fluorescencyjnym, taki jak Qubit, wiąże się specyficznie z DNA dwuniciowym. Absorbancja jest zwykle wyższa w surowych preparatach. Oba wyniki są bardzo zbliżone dla czystego, oczyszczonego dsDNA.

Mój A260 jest powyżej 1,5. Czy mogę go użyć?

Rozcieńcz próbkę i odczytaj ponownie. Większość spektrofotometrów traci liniowość przy wysokiej absorbancji, więc odczyt znacznie powyżej 1,5 zaniża prawdziwe stężenie. Wpisz współczynnik rozcieńczenia, aby kalkulator przeliczył wynik z powrotem na roztwór wyjściowy.