Kalkulator prawa Beera–Lamberta

Wyniki

Jak korzystać z kalkulatora prawa Beera–Lamberta

1. 1. Wybierz tryb. „A = εlc dla dowolnego członu” rozwiązuje prawo Beera–Lamberta; „Absorbancja ↔ transmitancja” przelicza pojedynczy odczyt.
2. 2. Wybierz, co chcesz obliczyć. Najczęściej jest to stężenie próbki z jej zmierzonej absorbancji, ale można też wyznaczyć ε i l. Pole odpowiedzi zmienia się w menu jednostek.
3. 3. Wpisz resztę z jednostkami. Molowy współczynnik absorpcji może być podany w M⁻¹ cm⁻¹, mM⁻¹ cm⁻¹ lub m² mol⁻¹; długość drogi optycznej w cm, mm lub m; stężenie od nM do M. Odczyt podany jako %T lub jako ułamek T jest najpierw przeliczany na absorbancję.
4. 4. Sprawdź uwagę o zakresie. Kalkulator ostrzega, gdy absorbancja jest poniżej około 0,1 albo powyżej około 1, czyli tam, gdzie większość spektrofotometrów traci dokładność.

Prawo Beera–Lamberta

A = ε × l × c

A = log₁₀(I₀ / I) = −log₁₀ T

%T = 100 × 10^(−A)

c = A / (ε × l)

A to absorbancja (liczba bez jednostki), ε to molowy współczynnik absorpcji przy użytej długości fali, l to długość drogi optycznej przez próbkę (1 cm w standardowej kuwecie), a c to stężenie absorbującego składnika. IUPAC nazywa ε molowym (dziesiętnym) współczynnikiem absorpcji; „molowy współczynnik ekstynkcji” to starsza, wciąż powszechna nazwa, a IUPAC odradza nazwę „molar absorptivity”. Jego zwykła jednostka to L mol⁻¹ cm⁻¹, czyli to samo co M⁻¹ cm⁻¹; jednostka SI to m² mol⁻¹, przy czym 1 m² mol⁻¹ równa się 10 M⁻¹ cm⁻¹.

Absorbancja jest logarytmiczna: każda jednostka A usuwa 90% tego, co zostało. Dlatego odczyt 2 oznacza, że przez próbkę przechodzi tylko 1% światła, a absorbancje sumują się dla próbek ustawionych jedna za drugą, podczas gdy transmitancje się mnożą.

Przykłady krok po kroku

Absorbancja NADH (domyślne dane). NADH absorbuje przy 340 nm z ε ≈ 6220 M⁻¹ cm⁻¹, wartością szeroko stosowaną w testach enzymatycznych (niektóre źródła podają około 6300, więc użyj wartości ze swojego laboratorium). Roztwór o stężeniu 100 µM w kuwecie 1,00 cm ma A = 6220 × 1,00 × 1,00 × 10⁻⁴ = 0,622, czyli 23,9% transmitancji.

Stężenie z odczytu. Próbka tego samego związku daje A = 0,450. Wtedy c = 0,450 ÷ (6220 × 1) = 7,23 × 10⁻⁵ M, czyli 72,3 µM. Gdy odczyt podano jako %T: 35,5% transmitancji to ta sama A = 0,450.

Wyznaczenie ε. Roztwór o stężeniu 40,0 µM daje A = 0,800 w kuwecie 1,00 cm, więc ε = 0,800 ÷ (1,00 × 4,00 × 10⁻⁵) = 20 000 M⁻¹ cm⁻¹. Zmniejszenie drogi optycznej do 0,5 cm zmniejszyłoby absorbancję o połowę.

Kiedy prawo przestaje działać

• Wysoka absorbancja. Powyżej A ≈ 1 detektor widzi głównie światło rozproszone, a wykres A względem c się wygina. Rozcieńcz próbkę i zmierz ponownie.
• Stężone roztwory. Powyżej około 10 mM cząsteczki oddziałują ze sobą i ε się zmienia.
• Szerokie pasmo. Prawo zakłada wąskie, monochromatyczne światło; IUPAC stwierdza, że obowiązuje ono tylko wtedy, gdy szerokość pasma jest mała w porównaniu z liniami widmowymi.
• Chemia w kuwecie. Dimeryzacja, jonizacja albo barwnik wrażliwy na pH zmieniają absorbujący składnik podczas rozcieńczania.
• Rozpraszanie i mętne próbki. Światło rozproszone poza wiązką jest liczone jako pochłonięte. Najpierw przefiltruj lub odwiruj próbkę.

Jeśli masz kilka wzorców zamiast ε z literatury, dopasuj zamiast tego prostą kalibracyjną: Kalkulator krzywej standardowej przyjmuje absorbancje znanych stężeń i odczytuje niewiadomą. Pamiętaj o odjęciu ślepej próby i trzymaj niewiadome w zakresie wzorców.

Najczęstsze pytania

Jaki jest wzór prawa Beera–Lamberta?

A = εlc: absorbancja równa się molowemu współczynnikowi absorpcji pomnożonemu przez długość drogi optycznej i stężenie. Mówi, że rozcieńczony roztwór pochłania światło proporcjonalnie do tego, ile absorbującego materiału przechodzi przez nie wiązka.

Jak obliczyć stężenie z absorbancji?

Podziel absorbancję przez ε i przez długość drogi optycznej: c = A ÷ (ε × l). Przy A = 0,450, ε = 6220 M⁻¹ cm⁻¹ i l = 1 cm, c = 7,23 × 10⁻⁵ M. Upewnij się, że absorbancja została skorygowana o ślepą próbę.

Jak przeliczyć absorbancję na transmitancję?

Transmitancja to 10 podniesione do potęgi minus absorbancja, T = 10^(−A); pomnóż przez 100, aby otrzymać procenty. Zatem A = 1 to 10% T, a A = 2 to 1% T. W odwrotnym kierunku: A = 2 − log₁₀(%T).

Jaki zakres absorbancji jest dobry dla spektrofotometru?

Mniej więcej od 0,1 do 1,0, co odpowiada około 80% do 10% transmitancji. Poniżej 0,1 sygnał jest bliski szumu, a powyżej około 1 światło rozproszone sprawia, że odpowiedź przestaje być liniowa. Rozcieńcz próbkę lub zmień długość drogi optycznej, aby mieściła się w zakresie.

Czym różni się molowy współczynnik ekstynkcji od molowego współczynnika absorpcji?

To ta sama wielkość. IUPAC zaleca „molowy (dziesiętny) współczynnik absorpcji”; „molowy współczynnik ekstynkcji” to starsza nazwa. Używa się też „molowej absorptywności”, ale IUPAC odradza tę nazwę.

Dlaczego moja krzywa kalibracji nie jest prostą przy wysokim stężeniu?

Prawo Beera–Lamberta jest prawem granicznym. Przy wysokiej absorbancji światło rozproszone, szerokie pasmo, oddziaływania cząsteczek lub równowagi chemiczne wyginają krzywą. Utrzymuj wzorce poniżej około A = 1 albo rozcieńcz niewiadomą do obszaru liniowego.