Calcolatore della Legge di Beer–Lambert

Risultati

Come usare il Calcolatore della Legge di Beer–Lambert

1. 1. Scegli la modalità. «A = εlc per qualsiasi termine» risolve la legge di Beer–Lambert; «Assorbanza ↔ trasmittanza» converte una singola lettura.
2. 2. Scegli che cosa trovare. Più spesso è la concentrazione di un campione dalla sua assorbanza misurata, ma anche ε e l si possono trovare. La casella della risposta diventa un menu delle unità.
3. 3. Inserisci il resto con le unità. Il coefficiente di assorbimento molare può essere in M⁻¹ cm⁻¹, mM⁻¹ cm⁻¹ o m² mol⁻¹; il cammino ottico in cm, mm o m; la concentrazione da nM a M. Una lettura data come %T o come frazione T viene prima convertita in assorbanza.
4. 4. Controlla la nota sull'intervallo. Il calcolatore avvisa quando l'assorbanza è inferiore a circa 0,1 o superiore a circa 1, dove la maggior parte degli strumenti perde accuratezza.

La legge di Beer–Lambert

A = ε × l × c

A = log₁₀(I₀ / I) = −log₁₀ T

%T = 100 × 10^(−A)

c = A / (ε × l)

A è l'assorbanza (un numero puro), ε il coefficiente di assorbimento molare alla lunghezza d'onda usata, l il cammino ottico attraverso il campione (1 cm per una cuvetta standard) e c la concentrazione della specie assorbente. La IUPAC chiama ε il coefficiente di assorbimento molare (decadico); «coefficiente di estinzione molare» è il nome più vecchio ma ancora comune, e la IUPAC sconsiglia «assorbività molare». L'unità usuale è L mol⁻¹ cm⁻¹, che equivale a M⁻¹ cm⁻¹; l'unità SI è m² mol⁻¹, e 1 m² mol⁻¹ equivale a 10 M⁻¹ cm⁻¹.

L'assorbanza è logaritmica: ogni unità di A elimina il 90% di ciò che resta. Per questo una lettura di 2 significa che passa solo l'1% della luce, e perché l'assorbanza si somma per campioni sovrapposti mentre la trasmittanza si moltiplica.

Esempi svolti

Assorbanza del NADH (i dati predefiniti). Il NADH assorbe a 340 nm con ε ≈ 6.220 M⁻¹ cm⁻¹, un valore molto usato nei saggi enzimatici (alcuni riferimenti danno circa 6.300, quindi usa quello del tuo laboratorio). Una soluzione da 100 µM in una cuvetta da 1,00 cm ha A = 6.220 × 1,00 × 1,00 × 10⁻⁴ = 0,622, cioè 23,9% di trasmittanza.

Concentrazione da una lettura. Un campione dello stesso composto dà A = 0,450. Allora c = 0,450 ÷ (6.220 × 1) = 7,23 × 10⁻⁵ M, cioè 72,3 µM. Se invece la lettura è data come %T: una trasmittanza del 35,5% corrisponde allo stesso A = 0,450.

Trovare ε. Una soluzione da 40,0 µM dà A = 0,800 in una cella da 1,00 cm, quindi ε = 0,800 ÷ (1,00 × 4,00 × 10⁻⁵) = 20.000 M⁻¹ cm⁻¹. Dimezzare il cammino ottico a 0,5 cm dimezzerebbe l'assorbanza.

Quando la legge smette di funzionare

• Assorbanza alta. Sopra A ≈ 1 il rivelatore vede soprattutto luce diffusa, e il grafico di A rispetto a c si curva. Diluisci e rimisura.
• Soluzioni concentrate. Sopra circa 10 mM le molecole interagiscono e ε cambia.
• Banda larga. La legge presuppone luce stretta e monocromatica; la IUPAC afferma che vale solo quando la banda è stretta rispetto alle righe spettrali.
• Chimica nella cuvetta. La dimerizzazione, la ionizzazione o un colorante sensibile al pH cambiano la specie assorbente man mano che lo diluisci.
• Dispersione e campioni torbidi. La luce diffusa fuori dal fascio viene contata come assorbita. Filtra o centrifuga prima.

Se hai diversi standard anziché un ε da letteratura, adatta invece una retta di calibrazione: il Calcolatore della curva standard prende le assorbanze di concentrazioni note e legge quella incognita. Ricordati di sottrarre un bianco e di mantenere le incognite entro l'intervallo degli standard.

Domande frequenti

Qual è la formula della legge di Beer–Lambert?

A = εlc: l'assorbanza è uguale al coefficiente di assorbimento molare per il cammino ottico per la concentrazione. Dice che una soluzione diluita assorbe la luce in proporzione alla quantità di materiale assorbente attraversato dal fascio.

Come calcolo la concentrazione dall'assorbanza?

Dividi l'assorbanza per ε e per il cammino ottico: c = A ÷ (ε × l). Con A = 0,450, ε = 6.220 M⁻¹ cm⁻¹ e l = 1 cm, c = 7,23 × 10⁻⁵ M. Assicurati che l'assorbanza sia stata corretta con il bianco.

Come converto l'assorbanza in trasmittanza?

La trasmittanza è 10 elevato alla meno l'assorbanza, T = 10^(−A); moltiplica per 100 per la percentuale. Quindi A = 1 equivale al 10% T e A = 2 all'1% T. Al contrario, A = 2 − log₁₀(%T).

Qual è un buon intervallo di assorbanza per uno spettrofotometro?

Circa da 0,1 a 1,0, pari a circa dall'80% al 10% di trasmittanza. Sotto 0,1 il segnale è vicino al rumore, e sopra circa 1 la luce diffusa rende la risposta non lineare. Diluisci o cambia il cammino ottico per riportare il campione nell'intervallo.

Qual è la differenza tra coefficiente di estinzione molare e coefficiente di assorbimento molare?

Sono la stessa grandezza. La IUPAC raccomanda «coefficiente di assorbimento molare (decadico)»; «coefficiente di estinzione molare» è il nome più vecchio. Si usa anche «assorbività molare», ma la IUPAC la sconsiglia.

Perché la mia curva di calibrazione non è una retta ad alta concentrazione?

La legge di Beer–Lambert è una legge limite. Ad alta assorbanza la luce diffusa, la banda larga, le interazioni molecolari o gli equilibri chimici incurvano la curva. Mantieni gli standard sotto circa A = 1, oppure diluisci l'incognita nella regione lineare.