Beer-Lambert-Gesetz-Rechner

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So verwenden Sie den Beer-Lambert-Gesetz-Rechner

1. 1. Wählen Sie den Modus. „A = εlc für jede Größe“ löst das Beer-Lambert-Gesetz. „Absorbanz ↔ Transmission“ rechnet eine einzelne Ablesung um.
2. 2. Wählen Sie die gesuchte Größe. Meist ist es die Konzentration einer Probe aus ihrer gemessenen Absorbanz, aber ε und l lassen sich ebenfalls berechnen. Das Antwortfeld wird zu einem Einheitenmenü.
3. 3. Geben Sie die übrigen Werte mit Einheiten ein. Der molare Absorptionskoeffizient kann in M⁻¹ cm⁻¹, mM⁻¹ cm⁻¹ oder m² mol⁻¹ angegeben werden; die Schichtdicke in cm, mm oder m; die Konzentration von nM bis M. Eine Ablesung in %T oder als Bruch T wird zuerst in Absorbanz umgerechnet.
4. 4. Prüfen Sie den Hinweis zum Messbereich. Der Rechner warnt, wenn die Absorbanz unter etwa 0,1 oder über etwa 1 liegt, wo die meisten Geräte an Genauigkeit verlieren.

Das Beer-Lambert-Gesetz

A = ε × l × c

A = log₁₀(I₀ / I) = −log₁₀ T

%T = 100 × 10^(−A)

c = A / (ε × l)

A ist die Absorbanz (eine reine Zahl), ε der molare Absorptionskoeffizient bei der verwendeten Wellenlänge, l die Schichtdicke, die der Strahl durch die Probe zurücklegt (1 cm bei einer Standardküvette), und c die Konzentration der absorbierenden Substanz. Die IUPAC nennt ε den molaren (dekadischen) Absorptionskoeffizienten. „Molarer Extinktionskoeffizient“ ist der ältere, weiterhin gebräuchliche Name; „molare Absorptivität“ rät die IUPAC ab. Die übliche Einheit ist L mol⁻¹ cm⁻¹, was M⁻¹ cm⁻¹ entspricht. Die SI-Einheit ist m² mol⁻¹, und 1 m² mol⁻¹ entspricht 10 M⁻¹ cm⁻¹.

Die Absorbanz ist logarithmisch: Jede Einheit von A entfernt 90 % des verbliebenen Lichts. Deshalb bedeutet eine Ablesung von 2, dass nur 1 % des Lichts durchkommt. Außerdem addieren sich Absorbanzen bei hintereinanderliegenden Proben, während sich Transmissionen multiplizieren.

Beispiele

Absorbanz von NADH (die Voreinstellungen). NADH absorbiert bei 340 nm mit ε ≈ 6220 M⁻¹ cm⁻¹, einem Wert, der in Enzymtests weit verbreitet ist (manche Quellen nennen etwa 6300, verwenden Sie daher den Wert Ihres Labors). Eine 100 µM-Lösung in einer 1,00 cm-Küvette hat A = 6220 × 1,00 × 1,00 × 10⁻⁴ = 0,622. Das entspricht 23,9 % Transmission.

Konzentration aus einer Ablesung. Eine Probe derselben Substanz zeigt A = 0,450. Dann ist c = 0,450 ÷ (6220 × 1) = 7,23 × 10⁻⁵ M, also 72,3 µM. Geben Sie die Ablesung stattdessen als %T ein: 35,5 % Transmission entsprechen demselben A = 0,450.

Bestimmung von ε. Eine 40,0 µM-Lösung ergibt A = 0,800 in einer 1,00 cm-Küvette, also ε = 0,800 ÷ (1,00 × 4,00 × 10⁻⁵) = 20.000 M⁻¹ cm⁻¹. Halbiert man die Schichtdicke auf 0,5 cm, halbiert sich die Absorbanz.

Wann das Gesetz nicht mehr gilt

• Hohe Absorbanz. Oberhalb von A ≈ 1 sieht der Detektor überwiegend Streulicht, und die Auftragung von A gegen c knickt ab. Verdünnen Sie die Probe und messen Sie erneut.
• Konzentrierte Lösungen. Oberhalb von etwa 10 mM wechselwirken die Moleküle, und ε ändert sich.
• Breite Bandbreite. Das Gesetz setzt schmales, monochromatisches Licht voraus. Die IUPAC stellt fest, dass es nur gilt, wenn die Bandbreite schmal gegenüber den Spektrallinien ist.
• Chemie in der Küvette. Dimerisierung, Ionisierung oder ein pH-empfindlicher Farbstoff verändern die absorbierende Spezies, wenn Sie verdünnen.
• Streuung und trübe Proben. Aus dem Strahl gestreutes Licht wird als absorbiert gezählt. Filtrieren oder zentrifugieren Sie die Probe vorher.

Wenn Sie statt eines Literaturwerts für ε mehrere Standards haben, passen Sie stattdessen eine Kalibriergerade an: Der Kalibriergeraden-Rechner nimmt Absorbanzen bekannter Konzentrationen und liest die unbekannte ab. Denken Sie daran, einen Leerwert abzuziehen, und halten Sie die Unbekannten innerhalb des Bereichs der Standards.

Häufig gestellte Fragen

Wie lautet die Formel des Beer-Lambert-Gesetzes?

A = εlc: Die Absorbanz ist gleich dem molaren Absorptionskoeffizienten mal Schichtdicke mal Konzentration. Sie besagt, dass eine verdünnte Lösung Licht im Verhältnis zur Menge des absorbierenden Materials absorbiert, die der Strahl durchquert.

Wie berechne ich die Konzentration aus der Absorbanz?

Teilen Sie die Absorbanz durch ε und durch die Schichtdicke: c = A ÷ (ε × l). Mit A = 0,450, ε = 6220 M⁻¹ cm⁻¹ und l = 1 cm ist c = 7,23 × 10⁻⁵ M. Achten Sie darauf, dass die Absorbanz um den Leerwert korrigiert ist.

Wie rechne ich Absorbanz in Transmission um?

Die Transmission ist 10 hoch minus der Absorbanz, T = 10^(−A); für Prozent multiplizieren Sie mit 100. A = 1 entspricht also 10 % T und A = 2 entspricht 1 % T. Umgekehrt gilt A = 2 − log₁₀(%T).

Welcher Absorbanzbereich ist für ein Spektralphotometer gut?

Etwa 0,1 bis 1,0, das entspricht rund 80 % bis 10 % Transmission. Unterhalb von 0,1 liegt das Signal nahe am Rauschen, oberhalb von etwa 1 macht Streulicht die Antwort nicht-linear. Verdünnen Sie die Probe oder ändern Sie die Schichtdicke, um sie in den Bereich zu bringen.

Was ist der Unterschied zwischen dem molaren Extinktionskoeffizienten und dem molaren Absorptionskoeffizienten?

Es ist dieselbe Größe. Die IUPAC empfiehlt „molarer (dekadischer) Absorptionskoeffizient“; „molarer Extinktionskoeffizient“ ist der ältere Name. „Molare Absorptivität“ wird ebenfalls verwendet, doch die IUPAC rät davon ab.

Warum ist meine Kalibriergerade bei hoher Konzentration keine Gerade?

Das Beer-Lambert-Gesetz ist ein Grenzgesetz. Bei hoher Absorbanz verbiegen Streulicht, breite Bandbreite, molekulare Wechselwirkungen oder chemische Gleichgewichte die Kurve. Halten Sie die Standards unter etwa A = 1 oder verdünnen Sie die Unbekannte in den linearen Bereich.