Калькулятор закона Бера — Ламберта

Результаты

Как пользоваться калькулятором закона Бера — Ламберта

1. 1. Выберите режим. «A = εlc для любой величины» решает закон Бера — Ламберта; «Оптическая плотность ↔ пропускание» пересчитывает одно показание.
2. 2. Выберите, что хотите найти. Чаще всего это концентрация образца по измеренной оптической плотности, но можно найти и ε, и l. Окно ответа превращается в меню единиц.
3. 3. Введите остальное с единицами. Молярный коэффициент поглощения может быть в M⁻¹ cm⁻¹, mM⁻¹ cm⁻¹ или m² mol⁻¹; длина пути — в cm, mm или m; концентрация — от nM до M. Показание, заданное в %T или как доля T, сначала переводится в оптическую плотность.
4. 4. Проверьте примечание о диапазоне. Калькулятор предупреждает, если оптическая плотность ниже примерно 0,1 или выше примерно 1, где большинство приборов теряют точность.

Закон Бера — Ламберта

A = ε × l × c

A = log₁₀(I₀ / I) = −log₁₀ T

%T = 100 × 10^(−A)

c = A / (ε × l)

A — оптическая плотность (безразмерное число), ε — молярный коэффициент поглощения на используемой длине волны, l — длина пути через образец (1 cm для стандартной кюветы), а c — концентрация поглощающего вещества. IUPAC называет ε молярным (десятичным) коэффициентом поглощения; «молярный коэффициент экстинкции» — более старое, но всё ещё распространённое название, а IUPAC советует не использовать «молярную поглощательную способность». Обычная единица — L mol⁻¹ cm⁻¹, то же, что M⁻¹ cm⁻¹; единица СИ — m² mol⁻¹, и 1 m² mol⁻¹ равен 10 M⁻¹ cm⁻¹.

Оптическая плотность логарифмическая: каждая единица A убирает 90% оставшегося света. Поэтому показание 2 означает, что проходит лишь 1% света, и поэтому оптическая плотность складывается для последовательных образцов, а пропускание перемножается.

Примеры расчётов

Оптическая плотность НАДН (введённые по умолчанию значения). NADH поглощает при 340 nm с ε ≈ 6220 M⁻¹ cm⁻¹ — значением, широко используемым в ферментативных анализах (в некоторых справочниках приводится около 6300, поэтому используйте значение вашей лаборатории). Раствор 100 µM в кювете 1,00 cm даёт A = 6220 × 1,00 × 1,00 × 10⁻⁴ = 0,622, что соответствует 23,9% пропускания.

Концентрация по показанию. Образец того же соединения даёт A = 0,450. Тогда c = 0,450 ÷ (6220 × 1) = 7,23 × 10⁻⁵ M, или 72,3 µM. Если показание дано как %T: пропускание 35,5% соответствует тому же A = 0,450.

Поиск ε. Раствор 40,0 µM даёт A = 0,800 в кювете 1,00 cm, поэтому ε = 0,800 ÷ (1,00 × 4,00 × 10⁻⁵) = 20 000 M⁻¹ cm⁻¹. Уменьшение длины пути вдвое, до 0,5 cm, вдвое уменьшит оптическую плотность.

Когда закон перестаёт работать

• Высокая оптическая плотность. Выше A ≈ 1 детектор видит в основном рассеянный свет, и график A от c изгибается. Разбавьте образец и измерьте снова.
• Концентрированные растворы. Выше примерно 10 mM молекулы взаимодействуют, и ε меняется.
• Широкая полоса пропускания. Закон предполагает узкий монохроматический свет; IUPAC указывает, что он выполняется, только если полоса пропускания мала по сравнению со спектральными линиями.
• Химия в кювете. Димеризация, ионизация или pH-чувствительный краситель меняют поглощающие частицы при разбавлении.
• Рассеяние и мутные образцы. Свет, рассеянный из пучка, учитывается как поглощённый. Сначала отфильтруйте образец или центрифугируйте его.

Если у вас есть несколько стандартов, а не литературное значение ε, постройте калибровочную прямую: Калькулятор калибровочной кривой берёт оптические плотности растворов известной концентрации и определяет неизвестную. Не забудьте вычесть холостую пробу и держите неизвестные внутри диапазона стандартов.

Часто задаваемые вопросы

Какая формула закона Бера — Ламберта?

A = εlc: оптическая плотность равна молярному коэффициенту поглощения, умноженному на длину пути и на концентрацию. Она означает, что разбавленный раствор поглощает свет пропорционально количеству поглощающего вещества на пути пучка.

Как рассчитать концентрацию по оптической плотности?

Разделите оптическую плотность на ε и на длину пути: c = A ÷ (ε × l). При A = 0,450, ε = 6220 M⁻¹ cm⁻¹ и l = 1 cm получаем c = 7,23 × 10⁻⁵ M. Убедитесь, что оптическая плотность скорректирована по холостой пробе.

Как пересчитать оптическую плотность в пропускание?

Пропускание равно 10 в степени минус оптическая плотность, T = 10^(−A); умножьте на 100, чтобы получить проценты. Таким образом, A = 1 соответствует 10% T, а A = 2 — 1% T. Обратно: A = 2 − log₁₀(%T).

Какой диапазон оптической плотности хорош для спектрофотометра?

Примерно от 0,1 до 1,0, что соответствует пропусканию примерно от 80% до 10%. Ниже 0,1 сигнал близок к шуму, а выше примерно 1 рассеянный свет делает отклик нелинейным. Разбавьте образец или измените длину пути, чтобы попасть в диапазон.

В чём разница между молярным коэффициентом экстинкции и молярным коэффициентом поглощения?

Это одна и та же величина. IUPAC рекомендует «молярный (десятичный) коэффициент поглощения»; «молярный коэффициент экстинкции» — более старое название. «Молярная поглощательная способность» тоже используется, но IUPAC советует её не применять.

Почему калибровочная кривая не прямая при высокой концентрации?

Закон Бера — Ламберта — предельный закон. При высокой оптической плотности рассеянный свет, широкая полоса пропускания, взаимодействие молекул или химические равновесия искривляют кривую. Держите стандарты ниже примерно A = 1 или разбавьте неизвестное до линейной области.