Calculateur de la loi de Beer–Lambert

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Comment utiliser le calculateur de la loi de Beer–Lambert

1. 1. Choisissez le mode. « A = εlc pour n'importe quel terme » résout la loi de Beer–Lambert ; « Absorbance ↔ transmittance » convertit une seule lecture.
2. 2. Choisissez ce que vous cherchez. Le plus souvent, c'est la concentration d'un échantillon à partir de son absorbance mesurée, mais ε et l peuvent aussi être trouvés. La case de réponse devient un menu d'unités.
3. 3. Saisissez le reste avec les unités. Le coefficient d'absorption molaire peut être en M⁻¹ cm⁻¹, mM⁻¹ cm⁻¹ ou m² mol⁻¹ ; la longueur de trajet en cm, mm ou m ; la concentration de nM à M. Une lecture donnée en %T ou en fraction T est d'abord convertie en absorbance.
4. 4. Vérifiez la note de plage. Le calculateur avertit lorsque l'absorbance est inférieure à environ 0,1 ou supérieure à environ 1, où la plupart des spectrophotomètres perdent en précision.

La loi de Beer–Lambert

A = ε × l × c

A = log₁₀(I₀ / I) = −log₁₀ T

%T = 100 × 10^(−A)

c = A / (ε × l)

A est l'absorbance (un nombre sans unité), ε le coefficient d'absorption molaire à la longueur d'onde utilisée, l la longueur de trajet traversée par l'échantillon (1 cm pour une cuve standard) et c la concentration de l'espèce absorbante. L'UICPA appelle ε le coefficient d'absorption molaire (décadique) ; « coefficient d'extinction molaire » est l'ancien nom, encore courant, et l'UICPA déconseille « absorptivité molaire ». Son unité usuelle est L mol⁻¹ cm⁻¹, identique à M⁻¹ cm⁻¹ ; l'unité SI est m² mol⁻¹, et 1 m² mol⁻¹ vaut 10 M⁻¹ cm⁻¹.

L'absorbance est logarithmique : chaque unité de A élimine 90 % de ce qui reste. C'est pourquoi une lecture de 2 signifie que seulement 1 % de la lumière traverse, et pourquoi l'absorbance s'additionne pour des échantillons superposés alors que la transmittance se multiplie.

Exemples détaillés

Absorbance du NADH (les valeurs par défaut). Le NADH absorbe à 340 nm avec ε ≈ 6220 M⁻¹ cm⁻¹, valeur largement utilisée dans les dosages enzymatiques (certaines références donnent environ 6300, utilisez donc celle de votre laboratoire). Une solution de 100 µM dans une cuve de 1,00 cm donne A = 6220 × 1,00 × 1,00 × 10⁻⁴ = 0,622, soit 23,9 % de transmittance.

Concentration à partir d'une lecture. Un échantillon du même composé donne A = 0,450. Alors c = 0,450 ÷ (6220 × 1) = 7,23 × 10⁻⁵ M, soit 72,3 µM. Si la lecture est donnée en %T, une transmittance de 35,5 % correspond à la même A = 0,450.

Trouver ε. Une solution à 40,0 µM donne A = 0,800 dans une cuve de 1,00 cm, donc ε = 0,800 ÷ (1,00 × 4,00 × 10⁻⁵) = 20 000 M⁻¹ cm⁻¹. Ramener la longueur de trajet à 0,5 cm diviserait l'absorbance par deux.

Quand la loi cesse de s'appliquer

• Absorbance élevée. Au-dessus de A ≈ 1, le détecteur ne voit surtout que de la lumière parasite, et la courbe de A en fonction de c s'infléchit. Diluez et mesurez à nouveau.
• Solutions concentrées. Au-delà d'environ 10 mM, les molécules interagissent et ε change.
• Bande passante large. La loi suppose une lumière étroite et monochromatique ; l'UICPA précise qu'elle n'est valable que si la largeur de bande est petite par rapport aux raies spectrales.
• Chimie dans la cuve. La dimérisation, l'ionisation ou un colorant sensible au pH change l'espèce absorbante lorsque vous la diluez.
• Diffusion et échantillons troubles. La lumière diffusée hors du faisceau est comptée comme absorbée. Filtrez ou centrifugez d'abord.

Si vous disposez de plusieurs étalons plutôt que d'un ε tiré de la littérature, ajustez plutôt une droite d'étalonnage : le calculateur de courbe d'étalonnage prend les absorbances de concentrations connues et lit l'inconnue. N'oubliez pas de soustraire un blanc, et gardez les inconnues dans la plage des étalons.

Questions fréquentes

Quelle est la formule de la loi de Beer–Lambert ?

A = εlc : l'absorbance égale le coefficient d'absorption molaire multiplié par la longueur de trajet et par la concentration. Elle signifie qu'une solution diluée absorbe la lumière en proportion de la quantité de matière absorbante que traverse le faisceau.

Comment calculer la concentration à partir de l'absorbance ?

Divisez l'absorbance par ε et par la longueur de trajet : c = A ÷ (ε × l). Avec A = 0,450, ε = 6220 M⁻¹ cm⁻¹ et l = 1 cm, c = 7,23 × 10⁻⁵ M. Assurez-vous que l'absorbance a été corrigée du blanc.

Comment convertir l'absorbance en transmittance ?

La transmittance est 10 élevé à la puissance moins l'absorbance, T = 10^(−A) ; multipliez par 100 pour obtenir le pourcentage. Ainsi A = 1 correspond à 10 % T et A = 2 à 1 % T. Inversement, A = 2 − log₁₀(%T).

Quelle est une bonne plage d'absorbance pour un spectrophotomètre ?

Environ 0,1 à 1,0, soit environ 80 % à 10 % de transmittance. En dessous de 0,1, le signal est proche du bruit ; au-dessus d'environ 1, la lumière parasite rend la réponse non linéaire. Diluez ou modifiez la longueur de trajet pour ramener un échantillon dans la plage.

Quelle est la différence entre le coefficient d'extinction molaire et le coefficient d'absorption molaire ?

Il s'agit de la même grandeur. L'UICPA recommande « coefficient d'absorption molaire (décadique) » ; « coefficient d'extinction molaire » est l'ancien nom. « Absorptivité molaire » est aussi utilisé, mais l'UICPA le déconseille.

Pourquoi ma courbe d'étalonnage n'est-elle pas une droite à forte concentration ?

La loi de Beer–Lambert est une loi limite. À forte absorbance, la lumière parasite, une bande passante large, les interactions moléculaires ou les équilibres chimiques courbent la courbe. Gardez les étalons en dessous d'environ A = 1, ou diluez l'inconnue pour la ramener dans la zone linéaire.