Công Cụ Tính Định Luật Beer–Lambert
Chọn đại lượng cần tìm — độ hấp thụ, hệ số hấp thụ mol, chiều dài đường truyền hoặc nồng độ — và nhập ba đại lượng còn lại theo đơn vị bạn có. Công cụ giải A = εlc, hiển thị các bước tính, và cho độ truyền qua phần trăm tương ứng. Chế độ thứ hai chỉ đổi qua lại giữa độ hấp thụ và độ truyền qua cho một số đọc. Miễn phí, không cần đăng ký.
ε tại bước sóng bạn đo. M⁻¹ cm⁻¹ giống với L mol⁻¹ cm⁻¹; đơn vị SI m² mol⁻¹ cho con số nhỏ hơn 10 lần.
Kết quả
0,622
Độ hấp thụ (A)
23,9%
Độ truyền qua (%T)
76,1%
Ánh sáng bị hấp thụ
Các bước tính
A = ε × l × c
Nồng độ (c): 100. µM = 1,0000 × 10⁻⁴ mol/L
A = 6220 × 1 × 1,0000 × 10⁻⁴ = 0,6220
%T = 10^(2 − A) = 10^(2 − 0,622) = 23,878113%
Cách Sử Dụng Công Cụ Tính Định Luật Beer–Lambert
- 1. Chọn chế độ. “A = εlc cho bất kỳ đại lượng nào” giải định luật Beer–Lambert; “Độ hấp thụ ↔ độ truyền qua” đổi một số đọc.
- 2. Chọn đại lượng cần tìm. Thường là nồng độ của mẫu từ độ hấp thụ đo được, nhưng ε và l cũng có thể tìm được. Ô đáp số sẽ chuyển thành menu đơn vị.
- 3. Nhập các giá trị còn lại kèm đơn vị. Hệ số hấp thụ mol có thể dùng M⁻¹ cm⁻¹, mM⁻¹ cm⁻¹ hoặc m² mol⁻¹; chiều dài đường truyền dùng cm, mm hoặc m; nồng độ từ nM đến M. Số đọc cho dưới dạng %T hoặc phân số T sẽ được đổi sang độ hấp thụ trước.
- 4. Kiểm tra lưu ý về khoảng đọc. Công cụ cảnh báo khi độ hấp thụ dưới khoảng 0,1 hoặc trên khoảng 1, nơi hầu hết máy đo mất độ chính xác.
Định Luật Beer–Lambert
Định luật
A = ε × l × c
Độ hấp thụ
A = log₁₀(I₀ / I) = −log₁₀ T
Độ truyền qua
%T = 100 × 10^(−A)
Nồng độ
c = A / (ε × l)
A là độ hấp thụ (một số không có đơn vị), ε là hệ số hấp thụ mol tại bước sóng đã dùng, l là chiều dài đường truyền qua mẫu (1 cm đối với cuvet tiêu chuẩn), và c là nồng độ của chất hấp thụ. IUPAC gọi ε là hệ số hấp thụ mol (thập phân); “hệ số tắt mol” là tên cũ hơn nhưng vẫn phổ biến, còn IUPAC khuyên không dùng “molar absorptivity”. Đơn vị thường dùng là L mol⁻¹ cm⁻¹, tức là M⁻¹ cm⁻¹; đơn vị SI là m² mol⁻¹, và 1 m² mol⁻¹ bằng 10 M⁻¹ cm⁻¹.
Độ hấp thụ có tính logarit: mỗi đơn vị A loại bỏ 90% phần ánh sáng còn lại. Đó là lý do số đọc 2 có nghĩa là chỉ 1% ánh sáng đi qua, và vì sao độ hấp thụ cộng dồn cho các mẫu xếp chồng trong khi độ truyền qua nhân lên.
| Độ hấp thụ (A) | Độ truyền qua (%T) | Ánh sáng bị hấp thụ |
|---|---|---|
| 0 | 100 | 0% |
| 0,1 | 79,4 | 20,6% |
| 0,3 | 50,1 | 49,9% |
| 0,5 | 31,6 | 68,4% |
| 1 | 10 | 90% |
| 2 | 1 | 99% |
| 3 | 0,1 | 99,9% |
Ví Dụ Minh Họa
Độ hấp thụ của NADH (dữ liệu mặc định). NADH hấp thụ ở 340 nm với ε ≈ 6.220 M⁻¹ cm⁻¹, một giá trị được dùng rộng rãi trong các thí nghiệm enzyme (một số tài liệu cho khoảng 6.300, nên hãy dùng giá trị của phòng thí nghiệm bạn). Dung dịch 100 µM trong cuvet 1,00 cm có A = 6.220 × 1,00 × 1,00 × 10⁻⁴ = 0,622, tức là độ truyền qua 23,9%.
Nồng độ từ một số đọc. Một mẫu cùng hợp chất đọc A = 0,450. Khi đó c = 0,450 ÷ (6.220 × 1) = 7,23 × 10⁻⁵ M, hay 72,3 µM. Nếu coi số đọc là %T: độ truyền qua 35,5% tương ứng với cùng A = 0,450.
Tìm ε. Dung dịch 40,0 µM cho A = 0,800 trong cuvet 1,00 cm, nên ε = 0,800 ÷ (1,00 × 4,00 × 10⁻⁵) = 20.000 M⁻¹ cm⁻¹. Giảm chiều dài đường truyền một nửa xuống 0,5 cm sẽ làm độ hấp thụ giảm một nửa.
Khi Định Luật Không Còn Đúng
- Độ hấp thụ cao. Trên A ≈ 1, máy dò chủ yếu thu ánh sáng lạc, và đường biểu diễn A theo c bị cong. Hãy pha loãng và đo lại.
- Dung dịch đậm đặc. Trên khoảng 10 mM, các phân tử tương tác với nhau và ε thay đổi.
- Băng thông rộng. Định luật giả định ánh sáng hẹp, đơn sắc; IUPAC nêu rằng nó chỉ đúng khi băng thông hẹp so với các vạch phổ.
- Hóa học trong cuvet. Sự kết cặp (đime hóa), ion hóa hoặc chất nhuộm nhạy pH làm thay đổi chất hấp thụ khi bạn pha loãng.
- Tán xạ và mẫu đục. Ánh sáng bị tán xạ khỏi chùm tia được tính là bị hấp thụ. Hãy lọc hoặc ly tâm trước.
Nếu bạn có nhiều mẫu chuẩn thay vì ε từ tài liệu, hãy khớp một đường hiệu chuẩn: Công Cụ Tính Đường Chuẩn nhận độ hấp thụ của các nồng độ đã biết và suy ra nồng độ của mẫu chưa biết. Nhớ trừ mẫu trắng, và giữ các mẫu chưa biết nằm trong khoảng của các mẫu chuẩn.
Câu Hỏi Thường Gặp
- Công thức định luật Beer–Lambert là gì?
- A = εlc: độ hấp thụ bằng hệ số hấp thụ mol nhân với chiều dài đường truyền nhân với nồng độ. Nó cho biết một dung dịch loãng hấp thụ ánh sáng tỷ lệ với lượng vật chất hấp thụ mà chùm tia đi qua.
- Làm thế nào để tính nồng độ từ độ hấp thụ?
- Chia độ hấp thụ cho ε và chiều dài đường truyền: c = A ÷ (ε × l). Với A = 0,450, ε = 6.220 M⁻¹ cm⁻¹ và l = 1 cm, c = 7,23 × 10⁻⁵ M. Hãy đảm bảo độ hấp thụ đã được hiệu chỉnh theo mẫu trắng.
- Làm thế nào để đổi độ hấp thụ sang độ truyền qua?
- Độ truyền qua bằng 10 lũy thừa âm của độ hấp thụ, T = 10^(−A); nhân với 100 để ra phần trăm. Vậy A = 1 là 10% T và A = 2 là 1% T. Ngược lại, A = 2 − log₁₀(%T).
- Khoảng độ hấp thụ tốt cho máy quang phổ là bao nhiêu?
- Khoảng 0,1 đến 1,0, tương ứng khoảng 80% đến 10% độ truyền qua. Dưới 0,1 tín hiệu gần với nhiễu, còn trên khoảng 1 ánh sáng lạc làm đáp ứng không còn tuyến tính. Hãy pha loãng hoặc thay đổi chiều dài đường truyền để đưa mẫu vào khoảng đo.
- Hệ số tắt mol và hệ số hấp thụ mol khác nhau thế nào?
- Chúng là cùng một đại lượng. IUPAC khuyến nghị “hệ số hấp thụ mol (thập phân)”; “hệ số tắt mol” là tên cũ hơn. “Molar absorptivity” cũng được dùng, nhưng IUPAC khuyên không dùng.
- Vì sao đường hiệu chuẩn của tôi không thẳng ở nồng độ cao?
- Định luật Beer–Lambert là một định luật giới hạn. Ở độ hấp thụ cao, ánh sáng lạc, băng thông rộng, tương tác phân tử hoặc cân bằng hóa học làm đường cong bị cong. Hãy giữ các mẫu chuẩn dưới khoảng A = 1, hoặc pha loãng mẫu chưa biết vào vùng tuyến tính.