Calculadora de concentração de DNA

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Como usar a calculadora de concentração de DNA

1. 1. Escolha o tipo de amostra. DNA de fita dupla (plasmídeos, produtos de PCR, DNA genômico), DNA de fita simples, RNA ou um oligonucleotídeo curto. Isso define o fator de conversão e, depois, a massa molecular.
2. 2. Insira as leituras. Digite a A₂₆₀. Adicione a A₂₈₀ e a A₂₃₀ para obter as razões de pureza, e uma leitura de fundo (A₃₂₀) se o seu protocolo a subtrair. Defina o caminho óptico e o fator de diluição se não forem 10 mm e 1.
3. 3. Opcional: adicione um volume e um comprimento. O volume dá o rendimento total em µg; o comprimento (pb para DNA de fita dupla, nt nos demais casos) acrescenta a molaridade e o pmol.
4. 4. Leia o resultado. A concentração, os veredictos de pureza e o cálculo completo aparecem juntos. Mude para o modo ng ↔ pmol para converter uma quantidade de DNA sem nenhum dado de absorbância.

Como a A260 se torna uma concentração

Ácidos nucleicos absorvem luz ultravioleta com mais força em 260 nm. Pela lei de Beer–Lambert, a absorbância é proporcional à concentração, então um único fator de conversão transforma uma leitura em uma concentração mássica:

O fator ε é específico para cada tipo de ácido nucleico. As perguntas frequentes do NanoDrop da Thermo Fisher listam esses valores, em ng·cm/µL, e uma nota técnica da New England Biolabs dá os mesmos três como µg/mL para um caminho de 10 mm:

São médias para uma composição de bases típica. Oligonucleotídeos curtos variam com a sequência — o coeficiente de extinção do próprio oligo, fornecido pelo fabricante, é mais preciso — e algumas referências listam outro valor para o DNA de fita simples, como 37 µg/mL. Use o campo de fator de conversão se o seu protocolo ou fornecedor especificar outro.

Como ler as razões de pureza

Proteínas absorvem perto de 280 nm e muitos contaminantes comuns absorvem perto de 230 nm, então duas razões dão uma verificação rápida do que mais há no tubo:

• A₂₆₀/A₂₈₀. Cerca de 1,8 para DNA puro (a NEB informa 1,85–1,88 em tampão) e cerca de 2,0–2,1 para RNA. Um valor baixo aponta para proteína ou fenol; um valor alto em uma preparação de DNA pode indicar RNA residual. Soluções ácidas leem mais baixo e as básicas, mais alto, então confira o pH do tampão.
• A₂₆₀/A₂₃₀. Um indicador mais sensível, geralmente 2,0–2,4 em amostras limpas. Sais de guanidina, EDTA, detergentes, fenol e carboidratos o reduzem. A NEB adverte que essa razão varia mais que a A₂₆₀/A₂₈₀ e deve ser lida com cuidado.
• O limiar comum. Na prática do dia a dia, ambas as razões acima de 1,8 são consideradas limpas o suficiente para a maioria das etapas seguintes.

Exemplo prático: uma miniprep de plasmídeo

Um plasmídeo de 5.000 pb é eluído em 50 µL, diluído 1 em 10 e lido em uma cubeta de 10 mm: A₂₆₀ = 0,412, A₂₈₀ = 0,222, A₂₃₀ = 0,18. Estes são os valores padrão da calculadora.

1. Concentração: 0,412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL.
2. Pureza: 0,412 ÷ 0,222 = 1,86 e 0,412 ÷ 0,18 = 2,29. Ambas ficam confortavelmente na faixa de limpeza.
3. Rendimento: 206 ng/µL × 50 µL = 10,3 µg de DNA no tubo.
4. Molaridade: 206 × 1.000 ÷ (660 × 5.000) = 0,06242 pmol/µL = 62,42 nM, o que dá 3,121 pmol no tubo.

Como converter entre ng e pmol

Receitas de clonagem e de ligação são escritas em picomoles, mas um espectrofotômetro fornece nanogramas. A conversão precisa do comprimento e de uma massa molecular média por par de bases ou nucleotídeo:

A conta de conferência: 1 µg de um fragmento de 1.000 pb equivale a 1,515 pmol (3,03 pmol de extremidades), o mesmo que o valor de 1,52 pmol por µg por quilobase que os fornecedores citam. A massa de 660 g/mol por par de bases é uma média; algumas fontes usam 650, o que muda o pmol em cerca de 1,5%. Para uma massa molecular exata de oligo, use o valor do fabricante. Para planejar a razão inserto-vetor a partir dessas quantidades, use a Calculadora de ligação.

Erros comuns

• Esquecer o fator de diluição. O valor da cubeta é o da amostra diluída; multiplique de volta para obter o estoque.
• Usar o fator do DNA de fita dupla para um oligo ou RNA. A diferença é de 33–50% no resultado.
• Ler fora da faixa linear. Mantenha a A₂₆₀ entre cerca de 0,1 e 1,5; dilua amostras concentradas e leia de novo.
• Confiar na absorbância para tudo. Nucleotídeos livres, RNA e fragmentos de fita simples também absorvem em 260 nm, então a absorbância superestima a quantidade de DNA de fita dupla íntegro em uma preparação bruta. Corantes fluorescentes específicos para DNA de fita dupla são mais seletivos quando isso importa.

Perguntas frequentes

Como calcular a concentração de DNA a partir da A260?

Multiplique a leitura da A260 pelo fator de conversão — 50 ng/µL para DNA de fita dupla, 33 para DNA de fita simples, 40 para RNA — e por qualquer fator de diluição. Uma A260 de 0,412 para DNA de fita dupla diluído 1 em 10 dá 0,412 × 50 × 10 = 206 ng/µL. Para um caminho diferente de 10 mm, escale por 10 dividido pelo caminho em milímetros.

Qual é uma boa razão A260/A280?

Cerca de 1,8 para DNA puro e cerca de 2,0 para RNA puro. A NEB informa 1,85–1,88 para DNA de fita dupla limpo em tampão e cerca de 2,1 para RNA. Razões claramente abaixo disso sugerem contaminação por proteína ou fenol; a razão também se desloca com o pH do tampão, então leia-a como um guia, e não como um teste de aprovação ou reprovação.

O que significa uma razão A260/A230 baixa?

Algo além de ácido nucleico está absorvendo em 230 nm. Os causadores mais comuns são sais de guanidina de kits de coluna, EDTA, detergentes, fenol e carboidratos residuais. Refaça a eluição ou a precipitação da amostra e confirme que o aparelho foi zerado com o mesmo tampão da amostra.

Como converter ng de DNA em pmol?

Divida a massa em nanogramas pela massa molecular, que é cerca de 660 g/mol por par de bases para DNA de fita dupla, e multiplique por 1.000. Para 100 ng de um plasmídeo de 3.000 pb: 100 × 1.000 ÷ (660 × 3.000) = 0,0505 pmol. A calculadora acima faz isso nos dois sentidos.

ng/µL é o mesmo que µg/mL?

Sim. Um nanograma por microlitro é 10⁻⁹ g por 10⁻⁶ L, o que equivale a 10⁻³ g/L ou 1 µg/mL. Por isso os fatores de conversão da A260 são citados nas duas unidades, como 50 ng/µL ou 50 µg/mL por unidade de absorbância.

Por que minha leitura do NanoDrop difere de uma medição no Qubit?

A absorbância conta qualquer coisa que absorva em 260 nm — RNA, nucleotídeos livres e contaminantes — enquanto um ensaio com corante fluorescente como o Qubit se liga especificamente ao DNA de fita dupla. A absorbância costuma dar o valor mais alto em preparações brutas. Os dois concordam de perto em DNA de fita dupla limpo e purificado.

Minha A260 está acima de 1,5. Ainda posso usá-la?

Dilua a amostra e leia de novo. A maioria dos espectrofotômetros perde a linearidade em absorbância alta, então uma leitura muito acima de 1,5 subestima a concentração real. Informe o fator de diluição para que a calculadora reescale a resposta para o estoque.