DNA-concentratiecalculator

Resultaten

Zo gebruik je de DNA-concentratiecalculator

1. 1. Kies het monstertype. dsDNA (plasmiden, PCR-producten, genomisch DNA), ssDNA, RNA of een kort oligonucleotide. Dit bepaalt de omrekeningsfactor en later het molecuulgewicht.
2. 2. Voer de metingen in. Typ A₂₆₀. Voeg A₂₈₀ en A₂₃₀ toe om de zuiverheidsratio's te krijgen, en een achtergrondmeting (A₃₂₀) als je protocol er één aftrekt. Stel de padlengte en de verdunningsfactor in als die niet 10 mm en 1 zijn.
3. 3. Optioneel: voeg een volume en een lengte toe. Het volume geeft de totale opbrengst in µg; de lengte (bp voor dsDNA, nt voor de rest) voegt molariteit en pmol toe.
4. 4. Lees het resultaat. De concentratie, de zuiverheidsoordelen en de volledige uitwerking staan samen. Schakel naar de modus ng ↔ pmol om een hoeveelheid DNA om te rekenen zonder absorbantiegegevens.

Van A260 naar een concentratie

Nucleïnezuren absorberen ultraviolet licht het sterkst bij 260 nm. Volgens de wet van Beer–Lambert is de absorbantie evenredig met de concentratie, dus één omrekeningsfactor zet een meting om in een massaconcentratie:

De factor ε is specifiek voor het type nucleïnezuur. De NanoDrop-FAQ van Thermo Fisher geeft deze waarden, in ng·cm/µL, en een technische notitie van New England Biolabs geeft dezelfde drie als µg/mL voor een pad van 10 mm:

Dit zijn gemiddelden voor een typische basensamenstelling. Korte oligonucleotiden variëren met hun sequentie — de extinctiecoëfficiënt die de fabrikant voor een oligo opgeeft is nauwkeuriger — en sommige referenties geven een andere waarde voor ssDNA, zoals 37 µg/mL. Gebruik het veld voor een eigen factor als je protocol of leverancier een andere factor voorschrijft.

De zuiverheidsratio's lezen

Eiwitten absorberen rond 280 nm en veel voorkomende verontreinigingen absorberen rond 230 nm, dus twee ratio's geven een snelle controle op wat er verder in de buis zit:

• A₂₆₀/A₂₈₀. Rond 1,8 voor zuiver DNA (NEB rapporteert 1,85–1,88 in buffer) en rond 2,0–2,1 voor RNA. Een lage waarde wijst op eiwit of fenol; een hoge waarde in een DNA-prep kan op RNA-overdracht duiden. Zure oplossingen lezen lager en basische hoger, dus controleer de pH van de buffer.
• A₂₆₀/A₂₃₀. Een gevoeliger indicator, meestal 2,0–2,4 voor zuivere monsters. Guanidinezouten, EDTA, detergentia, fenol en koolhydraten verlagen hem. NEB waarschuwt dat deze ratio meer varieert dan A₂₆₀/A₂₈₀ en met zorg moet worden gelezen.
• De gebruikelijke grens. In de dagelijkse praktijk tellen beide ratio's boven 1,8 als schoon genoeg voor de meeste vervolgstappen.

Uitgewerkt voorbeeld: een plasmide-miniprep

Een plasmide van 5.000 bp wordt geëlueerd in 50 µL, 1 op 10 verdund en gemeten in een kuvet van 10 mm: A₂₆₀ = 0,412, A₂₈₀ = 0,222, A₂₃₀ = 0,18. Dit zijn de standaardinvoerwaarden van de calculator.

1. Concentratie: 0,412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL.
2. Zuiverheid: 0,412 ÷ 0,222 = 1,86 en 0,412 ÷ 0,18 = 2,29. Beide liggen ruim binnen het schone bereik.
3. Opbrengst: 206 ng/µL × 50 µL = 10,3 µg DNA in de buis.
4. Molariteit: 206 × 1.000 ÷ (660 × 5.000) = 0,06242 pmol/µL = 62,42 nM, wat 3,121 pmol in de buis is.

Omrekenen tussen ng en pmol

Kloonrecepten en ligaties worden in picomol geschreven, maar een spectrofotometer geeft nanogram. De omrekening heeft de lengte nodig en een gemiddeld molecuulgewicht per basenpaar of nucleotide:

De bekende controle: 1 µg van een fragment van 1.000 bp is 1,515 pmol (3,03 pmol uiteinden), hetzelfde als de 1,52 pmol per µg per kilobase die leveranciers opgeven. De 660 g/mol per basenpaar is een gemiddelde; sommige bronnen gebruiken 650, wat de pmol met ongeveer 1,5% verandert. Gebruik voor een exact molecuulgewicht van een oligo de waarde van de fabrikant. Om uit deze hoeveelheden een insert-vectorverhouding te plannen, gebruik je de Ligatiecalculator.

Veelgemaakte fouten

• De verdunningsfactor vergeten. De waarde in de kuvet is het verdunde monster; vermenigvuldig terug om de voorraad te krijgen.
• De dsDNA-factor gebruiken voor een oligo of RNA. Het verschil is 33–50% in het antwoord.
• Buiten het lineaire bereik meten. Houd A₂₆₀ tussen ongeveer 0,1 en 1,5; verdun geconcentreerde monsters en meet opnieuw.
• Alles op absorbantie vertrouwen. Vrije nucleotiden, RNA en enkelstrengs fragmenten absorberen allemaal bij 260 nm, dus absorbantie overschat de hoeveelheid intact dubbelstrengs DNA in een ruwe prep. Fluorescente kleurstoffen die specifiek aan dsDNA binden, zijn selectiever als dat ertoe doet.

Veelgestelde vragen

Hoe bereken je de DNA-concentratie uit A260?

Vermenigvuldig de A260-meting met de omrekeningsfactor — 50 ng/µL voor dubbelstrengs DNA, 33 voor enkelstrengs DNA, 40 voor RNA — en met eventuele verdunningsfactor. Een A260 van 0,412 voor dsDNA, 1 op 10 verdund, geeft 0,412 × 50 × 10 = 206 ng/µL. Voor een andere padlengte schaal je met 10 gedeeld door de padlengte in millimeters.

Wat is een goede A260/A280-ratio?

Rond 1,8 voor zuiver DNA en rond 2,0 voor zuiver RNA. NEB rapporteert 1,85–1,88 voor schoon dubbelstrengs DNA in buffer en ongeveer 2,1 voor RNA. Ratio's duidelijk lager dan deze wijzen op eiwit- of fenolverontreiniging; de ratio wordt ook verschoven door de pH van de buffer, dus lees hem als richtlijn en niet als een harde goed-of-fout-test.

Wat betekent een lage A260/A230-ratio?

Iets anders dan nucleïnezuur absorbeert bij 230 nm. De gebruikelijke boosdoeners zijn guanidinezouten uit kolomkits, EDTA, detergentia, fenol en koolhydraatoverdracht. Zuiver het monster opnieuw (elueren of neerslaan) en controleer of het instrument met dezelfde buffer als het monster is geblankt.

Hoe reken je ng DNA om naar pmol?

Deel de massa in nanogram door het molecuulgewicht, ongeveer 660 g/mol per basenpaar voor dsDNA, en vermenigvuldig met 1.000. Voor 100 ng van een plasmide van 3.000 bp: 100 × 1.000 ÷ (660 × 3.000) = 0,0505 pmol. De calculator hierboven doet dit in beide richtingen.

Is ng/µL hetzelfde als µg/mL?

Ja. Eén nanogram per microliter is 10⁻⁹ g per 10⁻⁶ L, dat is 10⁻³ g/L of 1 µg/mL. Daarom worden de A260-omrekeningsfactoren ook op beide manieren genoemd, als 50 ng/µL of 50 µg/mL per absorbantie-eenheid.

Waarom wijkt mijn NanoDrop-meting af van een Qubit?

Absorbantie telt alles wat bij 260 nm absorbeert — RNA, vrije nucleotiden en verontreinigingen — terwijl een fluorescentietest zoals Qubit specifiek dubbelstrengs DNA bindt. Absorbantie is meestal het hogere getal bij ruwe preps. De twee komen dicht bij elkaar voor zuiver, gezuiverd dsDNA.

Mijn A260 is boven 1,5. Kan ik die toch gebruiken?

Verdun het monster en meet opnieuw. De meeste spectrofotometers verliezen hun lineariteit bij hoge absorbantie, dus een meting ver boven 1,5 onderschat de werkelijke concentratie. Vul de verdunningsfactor in zodat de calculator het antwoord terugrekent naar de voorraad.