Calculadora de concentración de ADN

Resultados

Cómo usar la calculadora de concentración de ADN

1. 1. Elige el tipo de muestra. ADN bicatenario (plásmidos, productos de PCR, ADN genómico), ADN monocatenario, ARN u oligonucleótido corto. Esto fija el factor de conversión y, más adelante, el peso molecular.
2. 2. Introduce las lecturas. Escribe A₂₆₀. Añade A₂₈₀ y A₂₃₀ para obtener los cocientes de pureza, y una lectura de fondo (A₃₂₀) si tu protocolo la resta. Ajusta la longitud de paso y el factor de dilución si no son 10 mm y 1.
3. 3. Opcional: añade un volumen y una longitud. El volumen da el rendimiento total en µg; la longitud (pb para ADN bicatenario, nt en el resto) añade la molaridad y los pmol.
4. 4. Lee el resultado. La concentración, los veredictos de pureza y el cálculo completo aparecen juntos. Cambia al modo ng ↔ pmol para convertir una cantidad de ADN sin datos de absorbancia.

Cómo se convierte A260 en una concentración

Los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta con más fuerza a 260 nm. Según la ley de Beer–Lambert, la absorbancia es proporcional a la concentración, así que un único factor de conversión transforma una lectura en una concentración másica:

El factor ε depende del tipo de ácido nucleico. La FAQ de NanoDrop de Thermo Fisher enumera estos valores en ng·cm/µL, y una nota técnica de New England Biolabs ofrece los mismos tres como µg/mL para una cubeta de 10 mm:

Son promedios para una composición de bases típica. Los oligonucleótidos cortos varían según su secuencia; el coeficiente de extinción que da el fabricante para el propio oligo es más preciso. Algunas referencias dan otro valor para el ADN monocatenario, como 37 µg/mL. Usa el campo de factor personalizado si tu protocolo o tu proveedor indica otro factor.

Cómo interpretar los cocientes de pureza

Las proteínas absorben cerca de 280 nm y muchos contaminantes habituales absorben cerca de 230 nm, así que dos cocientes dan una comprobación rápida de lo que hay en el tubo además del ácido nucleico:

• A₂₆₀/A₂₈₀. Unos 1,8 para ADN limpio (NEB indica 1,85–1,88 en tampón) y unos 2,0–2,1 para ARN. Un valor bajo apunta a proteína o fenol; un valor alto en una preparación de ADN puede indicar arrastre de ARN. Las soluciones ácidas dan lecturas más bajas y las básicas más altas, así que revisa el pH del tampón.
• A₂₆₀/A₂₃₀. Un indicador más sensible, normalmente 2,0–2,4 en muestras limpias. Las sales de guanidina, el EDTA, los detergentes, el fenol y los carbohidratos lo reducen. NEB advierte de que este cociente varía más que A₂₆₀/A₂₈₀ y debe leerse con cuidado.
• El umbral habitual. En la práctica diaria, ambos cocientes por encima de 1,8 se consideran lo bastante limpios para la mayoría de los usos posteriores.

Ejemplo desarrollado: una miniprep de plásmido

Un plásmido de 5.000 pb se eluye en 50 µL, se diluye 1 en 10 y se lee en una cubeta de 10 mm: A₂₆₀ = 0,412, A₂₈₀ = 0,222, A₂₃₀ = 0,18. Son los valores por defecto de la calculadora.

1. Concentración: 0,412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL.
2. Pureza: 0,412 ÷ 0,222 = 1,86 y 0,412 ÷ 0,18 = 2,29. Ambos están cómodamente en el rango limpio.
3. Rendimiento: 206 ng/µL × 50 µL = 10,3 µg de ADN en el tubo.
4. Molaridad: 206 × 1.000 ÷ (660 × 5.000) = 0,06242 pmol/µL = 62,42 nM, que son 3,121 pmol en el tubo.

Cómo convertir entre ng y pmol

Las recetas de clonación y ligación se escriben en picomoles, pero un espectrofotómetro da nanogramos. La conversión necesita la longitud y un peso molecular medio por par de bases o por nucleótido:

La comprobación habitual: 1 µg de un fragmento de 1.000 pb son 1,515 pmol (3,03 pmol de extremos), lo mismo que la cifra de 1,52 pmol por µg y por kilobase que dan los proveedores. El valor de 660 g/mol por par de bases es un promedio; algunas fuentes usan 650, lo que cambia los pmol en un 1,5 % aproximadamente. Para un peso molecular exacto de un oligo, usa el valor del fabricante. Para planificar la relación entre inserto y vector con estas cantidades, usa la Calculadora de ligación.

Errores comunes

• Olvidar el factor de dilución. La lectura de la cubeta corresponde a la muestra diluida; multiplica de vuelta para obtener el stock.
• Usar el factor del ADN bicatenario para un oligo o un ARN. La diferencia es del 33–50 % en el resultado.
• Leer fuera del rango lineal. Mantén A₂₆₀ entre aproximadamente 0,1 y 1,5; diluye las muestras concentradas y vuelve a leer.
• Fiarse de la absorbancia para todo. Los nucleótidos libres, el ARN y los fragmentos monocatenarios también absorben a 260 nm, así que la absorbancia sobreestima la cantidad de ADN bicatenario intacto en una preparación cruda. Los colorantes fluorescentes específicos para ADN bicatenario son más selectivos cuando eso importa.

Preguntas frecuentes

¿Cómo se calcula la concentración de ADN a partir de A260?

Multiplica la lectura de A260 por el factor de conversión (50 ng/µL para ADN bicatenario, 33 para monocatenario, 40 para ARN) y por el factor de dilución. Un A260 de 0,412 para ADN bicatenario diluido 1 en 10 da 0,412 × 50 × 10 = 206 ng/µL. Para una longitud de paso distinta de 10 mm, multiplica por 10 dividido entre la longitud de paso en milímetros.

¿Qué cociente A260/A280 es bueno?

Unos 1,8 para ADN puro y unos 2,0 para ARN puro. NEB indica 1,85–1,88 para ADN bicatenario limpio en tampón y unos 2,1 para ARN. Los cocientes claramente por debajo de estos valores sugieren contaminación con proteína o fenol; el pH del tampón también desplaza el cociente, así que úsalo como guía y no como una prueba de sí o no.

¿Qué significa un cociente A260/A230 bajo?

Algo distinto del ácido nucleico absorbe a 230 nm. Los culpables habituales son las sales de guanidina de los kits de columnas, el EDTA, los detergentes, el fenol y el arrastre de carbohidratos. Vuelve a eluir o a precipitar la muestra y asegúrate de que el instrumento se blanqueó con el mismo tampón que la muestra.

¿Cómo se convierten ng de ADN a pmol?

Divide la masa en nanogramos entre el peso molecular, que es de unos 660 g/mol por par de bases en ADN bicatenario, y multiplica por 1.000. Para 100 ng de un plásmido de 3.000 pb: 100 × 1.000 ÷ (660 × 3.000) = 0,0505 pmol. La calculadora de arriba hace esto en ambos sentidos.

¿ng/µL es lo mismo que µg/mL?

Sí. Un nanogramo por microlitro equivale a 10⁻⁹ g por 10⁻⁶ L, es decir, 10⁻³ g/L o 1 µg/mL. Por eso los factores de conversión de A260 se citan de las dos formas, como 50 ng/µL o 50 µg/mL por unidad de absorbancia.

¿Por qué mi lectura de NanoDrop difiere de la de Qubit?

La absorbancia cuenta cualquier cosa que absorba a 260 nm (ARN, nucleótidos libres y contaminantes), mientras que un ensayo con colorante fluorescente como Qubit se une específicamente al ADN bicatenario. La absorbancia suele dar la cifra más alta en preparaciones crudas. Ambos coinciden muy de cerca en ADN bicatenario limpio y purificado.

Mi A260 está por encima de 1,5. ¿Aún puedo usarla?

Diluye la muestra y vuelve a leer. La mayoría de los espectrofotómetros pierden linealidad con absorbancias altas, así que una lectura muy por encima de 1,5 subestima la concentración real. Introduce el factor de dilución para que la calculadora devuelva el resultado al stock.