Kalkulator Konsentrasi DNA

Hasil

Cara Menggunakan Kalkulator Konsentrasi DNA

1. 1. Pilih jenis sampel. dsDNA (plasmid, produk PCR, DNA genom), ssDNA, RNA, atau oligonukleotida pendek. Ini menentukan faktor konversi dan, nanti, berat molekul.
2. 2. Masukkan pembacaannya. Ketik A₂₆₀. Tambahkan A₂₈₀ dan A₂₃₀ untuk mendapatkan rasio kemurnian, serta pembacaan latar (A₃₂₀) jika protokol Anda mengurangkannya. Atur panjang lintasan dan faktor pengenceran jika tidak 10 mm dan 1.
3. 3. Opsional: tambahkan volume dan panjang. Volume memberikan hasil total dalam µg; panjang (bp untuk dsDNA, nt untuk lainnya) menambahkan molaritas dan pmol.
4. 4. Baca hasilnya. Konsentrasi, penilaian kemurnian, dan langkah perhitungan lengkap muncul bersamaan. Beralih ke mode ng ↔ pmol untuk mengonversi jumlah DNA tanpa data absorbansi.

Cara A260 Menjadi Konsentrasi

Asam nukleat menyerap cahaya ultraviolet paling kuat pada 260 nm. Menurut hukum Beer–Lambert, absorbansi sebanding dengan konsentrasi, sehingga satu faktor konversi mengubah pembacaan menjadi konsentrasi massa:

Faktor ε bergantung pada jenis asam nukleat. FAQ NanoDrop dari Thermo Fisher mencantumkan nilai-nilai ini, dalam ng·cm/µL, dan catatan teknis New England Biolabs memberikan ketiga nilai yang sama sebagai µg/mL untuk lintasan 10 mm:

Ini adalah rata-rata untuk komposisi basa yang umum. Oligonukleotida pendek bervariasi menurut urutannya — koefisien ekstingsi oligo dari pabrikan lebih akurat — dan beberapa referensi mencantumkan nilai berbeda untuk ssDNA, misalnya 37 µg/mL. Gunakan kolom penggantian jika protokol atau pemasok Anda menentukan faktor lain.

Membaca Rasio Kemurnian

Protein menyerap dekat 280 nm dan banyak kontaminan umum menyerap dekat 230 nm, sehingga dua rasio memberikan pemeriksaan cepat tentang apa lagi yang ada di dalam tabung:

• A₂₆₀/A₂₈₀. Sekitar 1,8 untuk DNA yang bersih (NEB melaporkan 1,85–1,88 dalam buffer) dan sekitar 2,0–2,1 untuk RNA. Nilai rendah menunjukkan protein atau fenol; nilai tinggi pada preparasi DNA bisa berarti RNA yang terbawa. Larutan asam terbaca lebih rendah dan larutan basa lebih tinggi, jadi periksa pH buffer.
• A₂₆₀/A₂₃₀. Indikator yang lebih sensitif, biasanya 2,0–2,4 untuk sampel bersih. Garam guanidin, EDTA, deterjen, fenol, dan karbohidrat menurunkannya. NEB memperingatkan bahwa rasio ini lebih bervariasi dibanding A₂₆₀/A₂₈₀ dan harus dibaca dengan hati-hati.
• Ambang umum. Dalam praktik sehari-hari, kedua rasio di atas 1,8 dianggap cukup bersih untuk sebagian besar pekerjaan lanjutan.

Contoh Kasus: Miniprep Plasmid

Plasmid 5.000 bp dilarutkan dalam 50 µL, diencerkan 1 dalam 10 dan dibaca dalam kuvet 10 mm: A₂₆₀ = 0,412, A₂₈₀ = 0,222, A₂₃₀ = 0,18. Ini adalah masukan bawaan kalkulator.

1. Konsentrasi: 0,412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL.
2. Kemurnian: 0,412 ÷ 0,222 = 1,86 dan 0,412 ÷ 0,18 = 2,29. Keduanya berada nyaman di kisaran bersih.
3. Hasil: 206 ng/µL × 50 µL = 10,3 µg DNA dalam tabung.
4. Molaritas: 206 × 1.000 ÷ (660 × 5.000) = 0,06242 pmol/µL = 62,42 nM, yaitu 3,121 pmol dalam tabung.

Mengonversi antara ng dan pmol

Resep kloning dan ligasi ditulis dalam pikomol, tetapi spektrofotometer memberikan nanogram. Konversi membutuhkan panjang dan berat molekul rata-rata per pasangan basa atau nukleotida:

Pemeriksaan yang familiar: 1 µg fragmen 1.000 bp adalah 1,515 pmol (3,03 pmol ujung), sama dengan angka 1,52 pmol per µg per kilobasa yang dikutip pemasok. 660 g/mol per pasangan basa adalah rata-rata; beberapa sumber memakai 650, yang mengubah pmol sekitar 1,5%. Untuk berat molekul oligo yang tepat, gunakan nilai dari pabrikan. Untuk merencanakan rasio insert terhadap vektor dari jumlah ini, gunakan Kalkulator Ligasi.

Kesalahan Umum

• Lupa faktor pengenceran. Pembacaan kuvet adalah sampel yang diencerkan; kalikan kembali untuk mendapatkan stok.
• Memakai faktor dsDNA untuk oligo atau RNA. Selisihnya 33–50% pada jawaban.
• Membaca di luar rentang linear. Jaga A₂₆₀ kira-kira antara 0,1 dan 1,5; encerkan sampel pekat dan baca ulang.
• Mempercayai absorbansi untuk semuanya. Nukleotida bebas, RNA, dan fragmen untai tunggal semuanya menyerap pada 260 nm, sehingga absorbansi melebih-lebihkan jumlah DNA untai ganda yang utuh dalam preparasi kasar. Pewarna fluoresen yang spesifik untuk dsDNA lebih selektif jika itu penting.

Pertanyaan yang Sering Diajukan

Bagaimana cara menghitung konsentrasi DNA dari A260?

Kalikan pembacaan A260 dengan faktor konversi — 50 ng/µL untuk DNA untai ganda, 33 untuk DNA untai tunggal, 40 untuk RNA — dan dengan faktor pengenceran apa pun. A260 sebesar 0,412 untuk dsDNA yang diencerkan 1 dalam 10 memberikan 0,412 × 50 × 10 = 206 ng/µL. Untuk lintasan selain 10 mm, skalakan dengan 10 dibagi panjang lintasan dalam milimeter.

Berapa rasio A260/A280 yang baik?

Sekitar 1,8 untuk DNA murni dan sekitar 2,0 untuk RNA murni. NEB melaporkan 1,85–1,88 untuk dsDNA bersih dalam buffer dan sekitar 2,1 untuk RNA. Rasio yang jelas di bawah nilai ini menunjukkan kontaminasi protein atau fenol; rasio juga bergeser karena pH buffer, jadi bacalah sebagai panduan dan bukan uji lulus-gagal.

Apa arti rasio A260/A230 yang rendah?

Ada sesuatu selain asam nukleat yang menyerap pada 230 nm. Penyebab yang biasa adalah garam guanidin dari kit kolom, EDTA, deterjen, fenol, dan sisa karbohidrat. Elusi ulang atau presipitasi ulang sampel, dan pastikan instrumen diblanko dengan buffer yang sama seperti sampel.

Bagaimana cara mengonversi ng DNA menjadi pmol?

Bagi massa dalam nanogram dengan berat molekul, yaitu sekitar 660 g/mol per pasangan basa untuk dsDNA, lalu kalikan dengan 1.000. Untuk 100 ng plasmid 3.000 bp: 100 × 1.000 ÷ (660 × 3.000) = 0,0505 pmol. Konverter di atas melakukan ini ke dua arah.

Apakah ng/µL sama dengan µg/mL?

Ya. Satu nanogram per mikroliter adalah 10⁻⁹ g per 10⁻⁶ L, yaitu 10⁻³ g/L atau 1 µg/mL. Itulah sebabnya faktor konversi A260 dikutip dalam kedua satuan, sebagai 50 ng/µL atau 50 µg/mL per unit absorbansi.

Mengapa pembacaan NanoDrop saya berbeda dengan Qubit?

Absorbansi menghitung apa pun yang menyerap pada 260 nm — RNA, nukleotida bebas, dan kontaminan — sedangkan uji pewarna fluoresen seperti Qubit mengikat DNA untai ganda secara spesifik. Absorbansi biasanya angka yang lebih tinggi pada preparasi kasar. Keduanya sangat mirip pada DNA untai ganda yang bersih dan dimurnikan.

A260 saya di atas 1,5. Masih bisakah saya memakainya?

Encerkan sampel dan baca ulang. Sebagian besar spektrofotometer kehilangan linearitas pada absorbansi tinggi, sehingga pembacaan jauh di atas 1,5 meremehkan konsentrasi sebenarnya. Masukkan faktor pengenceran agar kalkulator mengembalikan jawaban ke stok.