Công Cụ Tính Nồng Độ DNA

Kết quả

Cách Sử Dụng Công Cụ Tính Nồng Độ DNA

1. 1. Chọn loại mẫu. dsDNA (plasmid, sản phẩm PCR, DNA hệ gen), ssDNA, RNA hoặc oligonucleotide ngắn. Lựa chọn này đặt hệ số chuyển đổi và, sau đó, khối lượng phân tử.
2. 2. Nhập số đọc. Nhập A₂₆₀. Thêm A₂₈₀ và A₂₃₀ để có tỉ lệ độ tinh sạch, và số đọc nền A₃₂₀ nếu giao thức của bạn trừ đi nền. Đặt chiều dài đường truyền và hệ số pha loãng nếu chúng không phải là 10 mm và 1.
3. 3. Tùy chọn: thêm thể tích và chiều dài. Thể tích cho tổng lượng thu tính bằng µg; chiều dài (bp với dsDNA, nt với các loại khác) thêm nồng độ mol và pmol.
4. 4. Đọc kết quả. Nồng độ, nhận định độ tinh sạch và toàn bộ các bước tính hiện cùng lúc. Chuyển sang chế độ ng ↔ pmol để chuyển đổi một lượng DNA mà không cần dữ liệu độ hấp thụ.

A260 Trở Thành Nồng Độ Như Thế Nào

Axit nucleic hấp thụ tia cực tím mạnh nhất ở 260 nm. Theo định luật Beer–Lambert, độ hấp thụ tỉ lệ với nồng độ, nên một hệ số chuyển đổi biến số đọc thành nồng độ khối lượng:

Hệ số ε phụ thuộc vào loại axit nucleic. Mục FAQ NanoDrop của Thermo Fisher liệt kê các giá trị này theo ng·cm/µL, và một ghi chú kỹ thuật của New England Biolabs đưa ra ba giá trị tương tự dưới dạng µg/mL với đường truyền 10 mm:

Đây là giá trị trung bình cho thành phần base thông thường. Các oligonucleotide ngắn thay đổi theo trình tự — hệ số tắt phân tử của oligo do nhà sản xuất cung cấp sẽ chính xác hơn — và một số tài liệu tham khảo liệt kê giá trị khác cho ssDNA, chẳng hạn 37 µg/mL. Dùng ô ghi đè nếu giao thức hoặc nhà cung cấp của bạn quy định một hệ số khác.

Đọc Các Tỉ Lệ Độ Tinh Sạch

Protein hấp thụ gần 280 nm và nhiều tạp chất thông thường hấp thụ gần 230 nm, nên hai tỉ lệ cho một cách kiểm tra nhanh xem trong ống còn có gì khác:

• A₂₆₀/A₂₈₀. Khoảng 1,8 với DNA tinh khiết (NEB ghi 1,85–1,88 trong dung dịch đệm) và khoảng 2,0–2,1 với RNA. Giá trị thấp cho thấy protein hoặc phenol; giá trị cao trong mẫu DNA có thể do RNA còn sót lại. Dung dịch có tính axit cho số đọc thấp hơn và dung dịch có tính bazơ cho số cao hơn, nên hãy kiểm tra pH của đệm.
• A₂₆₀/A₂₃₀. Chỉ số nhạy hơn, thường là 2,0–2,4 với mẫu sạch. Muối guanidin, EDTA, chất tẩy rửa, phenol và carbohydrate làm giá trị này thấp xuống. NEB cảnh báo rằng tỉ lệ này biến thiên nhiều hơn A₂₆₀/A₂₈₀ và cần đọc thận trọng.
• Ngưỡng thường dùng. Trong thực hành hằng ngày, cả hai tỉ lệ trên 1,8 được coi là đủ sạch cho hầu hết các bước tiếp theo.

Ví Dụ Minh Họa: Một Lần Tách Plasmid

Một plasmid 5.000 bp được rửa giải trong 50 µL, pha loãng 1 trên 10 và đo trong cuvet 10 mm: A₂₆₀ = 0,412, A₂₈₀ = 0,222, A₂₃₀ = 0,18. Đây là các giá trị mặc định của công cụ.

1. Nồng độ: 0,412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL.
2. Độ tinh sạch: 0,412 ÷ 0,222 = 1,86 và 0,412 ÷ 0,18 = 2,29. Cả hai đều nằm gọn trong khoảng sạch.
3. Tổng lượng: 206 ng/µL × 50 µL = 10,3 µg DNA trong ống.
4. Nồng độ mol: 206 × 1.000 ÷ (660 × 5.000) = 0,06242 pmol/µL = 62,42 nM, tức là 3,121 pmol trong ống.

Chuyển Đổi Giữa ng và pmol

Công thức ligation và cloning được viết theo picomol, nhưng máy quang phổ cho kết quả theo nanogram. Phép chuyển đổi cần chiều dài và khối lượng phân tử trung bình trên mỗi cặp base hoặc nucleotide:

Phép kiểm tra quen thuộc: 1 µg đoạn 1.000 bp là 1,515 pmol (3,03 pmol đầu mút DNA), giống con số 1,52 pmol trên mỗi µg trên mỗi kilobase mà các nhà cung cấp đưa ra. 660 g/mol trên mỗi cặp base là giá trị trung bình; một số nguồn dùng 650, làm thay đổi pmol khoảng 1,5%. Với khối lượng phân tử oligo chính xác, hãy dùng giá trị của nhà sản xuất. Để lập tỉ lệ insert trên vector từ các lượng này, hãy dùng Ligation Calculator.

Các Lỗi Thường Gặp

• Quên hệ số pha loãng. Số đọc trong cuvet là mẫu đã pha loãng; hãy nhân ngược lại để có mẫu gốc.
• Dùng hệ số của dsDNA cho oligo hoặc RNA. Chênh lệch là 33–50% trong kết quả.
• Đọc ngoài vùng tuyến tính. Giữ A₂₆₀ trong khoảng từ khoảng 0,1 đến 1,5; pha loãng mẫu đậm đặc rồi đọc lại.
• Tin tưởng độ hấp thụ trong mọi trường hợp. Nucleotide tự do, RNA và các đoạn sợi đơn đều hấp thụ ở 260 nm, nên độ hấp thụ làm đánh giá cao lượng DNA sợi kép nguyên vẹn trong một chế phẩm thô. Thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu với DNA sợi kép sẽ chọn lọc hơn khi điều đó quan trọng.

Câu Hỏi Thường Gặp

Làm sao tính nồng độ DNA từ A260?

Nhân số đọc A260 với hệ số chuyển đổi — 50 ng/µL với DNA sợi kép, 33 với DNA sợi đơn, 40 với RNA — rồi nhân với hệ số pha loãng nếu có. Số đọc A260 là 0,412 với dsDNA pha loãng 1 trên 10 cho 0,412 × 50 × 10 = 206 ng/µL. Với đường truyền khác 10 mm, nhân với 10 rồi chia cho chiều dài đường truyền tính bằng mm.

Tỉ lệ A260/A280 tốt là bao nhiêu?

Khoảng 1,8 với DNA tinh khiết và khoảng 2,0 với RNA tinh khiết. NEB ghi 1,85–1,88 với dsDNA sạch trong đệm và khoảng 2,1 với RNA. Tỉ lệ thấp hơn rõ rệt so với các mức này gợi ý nhiễm protein hoặc phenol; tỉ lệ cũng bị lệch theo pH của đệm, nên hãy xem đây là chỉ dẫn chứ không phải phép thử đạt hay không đạt.

Tỉ lệ A260/A230 thấp có nghĩa là gì?

Có chất khác không phải axit nucleic đang hấp thụ ở 230 nm. Các thủ phạm thường gặp là muối guanidin từ bộ kit cột, EDTA, chất tẩy rửa, phenol và carbohydrate còn sót lại. Hãy rửa giải hoặc kết tủa lại mẫu, và đảm bảo máy đã được chuẩn nền bằng cùng loại đệm với mẫu.

Làm sao chuyển ng DNA sang pmol?

Chia khối lượng tính bằng nanogram cho khối lượng phân tử, khoảng 660 g/mol trên mỗi cặp base với dsDNA, rồi nhân với 1.000. Với 100 ng plasmid 3.000 bp: 100 × 1.000 ÷ (660 × 3.000) = 0,0505 pmol. Công cụ ở trên làm được cả hai chiều.

ng/µL có giống µg/mL không?

Có. Một nanogram trên microlít là 10⁻⁹ g trên 10⁻⁶ L, tức 10⁻³ g/L hay 1 µg/mL. Đó là lý do các hệ số chuyển đổi A260 được ghi theo cả hai cách, như 50 ng/µL hoặc 50 µg/mL trên mỗi đơn vị độ hấp thụ.

Vì sao số đọc NanoDrop khác với Qubit?

Độ hấp thụ tính mọi thứ hấp thụ ở 260 nm — RNA, nucleotide tự do và tạp chất — trong khi thuốc nhuộm huỳnh quang trong xét nghiệm như Qubit chỉ gắn đặc hiệu với DNA sợi kép. Độ hấp thụ thường cho số cao hơn với chế phẩm thô. Hai phương pháp khớp nhau gần đúng với dsDNA sạch, đã tinh chế.

A260 của tôi lớn hơn 1,5. Tôi có dùng được không?

Hãy pha loãng mẫu và đọc lại. Đa số máy quang phổ mất tính tuyến tính khi độ hấp thụ cao, nên số đọc cao hơn hẳn 1,5 sẽ đánh giá thấp nồng độ thực. Nhập hệ số pha loãng để công cụ quy đổi kết quả về mẫu gốc.