DNA Konsantrasyonu Hesaplayıcı

Sonuçlar

DNA Konsantrasyonu Hesaplayıcı Nasıl Kullanılır

1. 1. Örnek türünü seçin. dsDNA (plazmitler, PCR ürünleri, genomik DNA), ssDNA, RNA ya da kısa bir oligonükleotit. Bu, dönüşüm faktörünü ve daha sonra moleküler ağırlığı belirler.
2. 2. Okumaları girin. A₂₆₀ değerini yazın. Saflık oranlarını almak için A₂₈₀ ve A₂₃₀ ekleyin; protokolünüz bir arka plan okuması (A₃₂₀) çıkarıyorsa onu da ekleyin. Yol uzunluğu ve seyreltme faktörü 10 mm ve 1 değilse bunları ayarlayın.
3. 3. İsteğe bağlı: bir hacim ve uzunluk ekleyin. Hacim toplam verimi µg cinsinden verir; uzunluk (dsDNA için bp, diğerleri için nt) molarite ve pmol ekler.
4. 4. Sonucu okuyun. Konsantrasyon, saflık yargıları ve tüm çalışma birlikte görünür. Absorbans verisi olmadan bir DNA miktarını dönüştürmek için ng ↔ pmol kipine geçin.

A260 Bir Konsantrasyona Nasıl Dönüşür

Nükleik asitler ultraviyole ışığı en güçlü 260 nm'de soğurur. Beer–Lambert yasasına göre absorbans konsantrasyonla orantılıdır; bu yüzden tek bir dönüşüm faktörü okumayı bir kütle konsantrasyonuna çevirir:

ε faktörü nükleik asit türüne özgüdür. Thermo Fisher'ın NanoDrop sıkça sorulan sorular sayfası bu değerleri ng·cm/µL cinsinden listeler; bir New England Biolabs teknik notu aynı üç değeri 10 mm yol için µg/mL olarak verir:

Bunlar tipik baz bileşimi için ortalamalardır. Kısa oligonükleotitler dizilerine göre değişir — üreticinin verdiği oligonun kendi sönüm katsayısı daha doğrudur — ve bazı kaynaklar tek sarmallı DNA için farklı bir değer, örneğin 37 µg/mL, listeler. Protokolünüz ya da tedarikçiniz başka bir faktör belirtiyorsa geçersiz kılma alanını kullanın.

Saflık Oranlarını Okumak

Proteinler 280 nm civarında, birçok yaygın kirletici ise 230 nm civarında soğurur; bu yüzden iki oran, tüpte başka neyin bulunduğuna dair hızlı bir denetim sağlar:

• A₂₆₀/A₂₈₀. Temiz DNA için yaklaşık 1,8 (NEB tamponda 1,85–1,88 bildirir), RNA için yaklaşık 2,0–2,1. Düşük bir değer protein ya da fenole işaret eder; bir DNA hazırlığında yüksek bir değer RNA taşınmasından kaynaklanabilir. Asidik çözeltiler düşük, bazik olanlar yüksek okur; bu yüzden tamponun pH'ını denetleyin.
• A₂₆₀/A₂₃₀. Daha hassas bir göstergedir; temiz örneklerde genellikle 2,0–2,4. Guanidin tuzları, EDTA, deterjanlar, fenol ve karbonhidrat onu düşürür. NEB, bu oranın A₂₆₀/A₂₈₀'den daha çok değiştiği ve dikkatle okunması gerektiği konusunda uyarır.
• Yaygın eşik. Günlük uygulamada her iki oran da 1,8'in üzerindeyse çoğu sonraki çalışma için yeterince temiz sayılır.

Çalışılmış Örnek: Bir Plazmit Miniprep

5.000 bp'lik bir plazmit 50 µL'de elüe edilmiş, 10 kat seyreltilmiş ve 10 mm'lik bir küvette okunmuş: A₂₆₀ = 0,412, A₂₈₀ = 0,222, A₂₃₀ = 0,18. Bunlar hesaplayıcının varsayılan girdileridir.

1. Konsantrasyon: 0,412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL.
2. Saflık: 0,412 ÷ 0,222 = 1,86 ve 0,412 ÷ 0,18 = 2,29. Her ikisi de temiz aralıkta rahatça yer alır.
3. Verim: 206 ng/µL × 50 µL = 10,3 µg DNA tüpte.
4. Molarite: 206 × 1.000 ÷ (660 × 5.000) = 0,06242 pmol/µL = 62,42 nM, bu da tüpte 3,121 pmol demektir.

ng ve pmol Arasında Dönüştürme

Klonlama ve ligasyon tarifleri pikomol cinsinden yazılır, ama spektrofotometre nanogram verir. Dönüşüm, uzunluğu ve baz çifti ya da nükleotit başına ortalama bir moleküler ağırlığı gerektirir:

Tanıdık bir kontrol: 1.000 bp'lik bir parçanın 1 µg'ı 1,515 pmol'dür (3,03 pmol uç), tedarikçilerin verdiği, µg başına kilobaz başına 1,52 pmol rakamıyla aynıdır. Baz çifti başına 660 g/mol bir ortalamadır; bazı kaynaklar 650 kullanır ve bu pmol'ü yaklaşık yüzde 1,5 değiştirir. Kesin bir oligo moleküler ağırlığı için bunun yerine üreticinin değerini kullanın. Bu miktarlardan bir insert-vektör oranını planlamak için Ligasyon Hesaplayıcı aracını kullanın.

Yaygın Hatalar

• Seyreltme faktörünü unutmak. Küvetteki değer seyreltilmiş örnektir; stok değerini bulmak için geri çarpın.
• Bir oligo ya da RNA için çift sarmallı DNA faktörünü kullanmak. Fark cevapta yüzde 33–50'ye ulaşır.
• Doğrusal aralığın dışında okumak. A₂₆₀'ı yaklaşık 0,1 ile 1,5 arasında tutun; yoğun örnekleri seyreltip yeniden okuyun.
• Her şey için absorbansa güvenmek. Serbest nükleotitler, RNA ve tek sarmallı parçalar hepsi 260 nm'de soğurur; bu yüzden absorbans, ham bir hazırlıkta bozulmamış çift sarmallı DNA miktarını olduğundan fazla gösterir. Bu önemliyse çift sarmallı DNA'ya özgü floresan boyalar daha seçicidir.

Sık sorulan sorular

A260'tan DNA konsantrasyonu nasıl hesaplanır?

A260 okumasını dönüşüm faktörüyle — çift sarmallı DNA için 50 ng/µL, tek sarmallı DNA için 33, RNA için 40 — ve varsa seyreltme faktörüyle çarpın. 10 kat seyreltilmiş bir dsDNA için A260 0,412, 0,412 × 50 × 10 = 206 ng/µL verir. 10 mm'den farklı bir yol için, 10'u milimetre cinsinden yol uzunluğuna bölünen değerle ölçekleyin.

İyi bir A260/A280 oranı nedir?

Saf DNA için yaklaşık 1,8, saf RNA için yaklaşık 2,0. NEB, tamponda temiz çift sarmallı DNA için 1,85–1,88, RNA için yaklaşık 2,1 bildirir. Bu değerlerin belirgin olarak altındaki oranlar protein ya da fenol kirlenmesine işaret eder; oran tamponun pH'ından da kayar, bu yüzden onu bir kılavuz olarak okuyun, geçti-kaldı testi olarak değil.

Düşük bir A260/A230 oranı ne anlama gelir?

Nükleik asit dışında bir şey 230 nm'de soğuruyordur. Olağan suçlular kit kolonlarından gelen guanidin tuzları, EDTA, deterjanlar, fenol ve karbonhidrat taşınmasıdır. Örneği yeniden elüe edin ya da yeniden çöktürün ve cihazın örnekle aynı tamponla sıfırlandığından emin olun.

ng DNA'yı pmol'e nasıl dönüştürürüm?

Nanogram cinsinden kütleyi moleküler ağırlığa bölün — çift sarmallı DNA için baz çifti başına yaklaşık 660 g/mol — ve 1.000 ile çarpın. 3.000 bp'lik bir plazmitin 100 ng'ı için: 100 × 1.000 ÷ (660 × 3.000) = 0,0505 pmol. Yukarıdaki dönüştürücü her iki yönde de bunu yapar.

ng/µL, µg/mL ile aynı mı?

Evet. Mikrolitre başına bir nanogram, 10⁻⁹ g bölü 10⁻⁶ L'dir; bu da 10⁻³ g/L ya da 1 µg/mL eder. Bu yüzden A260 dönüşüm faktörleri her iki biçimde de verilir: absorbans birimi başına 50 ng/µL ya da 50 µg/mL.

NanoDrop okuması neden Qubit'ten farklı?

Absorbans, 260 nm'de soğuran her şeyi sayar — RNA, serbest nükleotitler ve kirleticiler — oysa Qubit gibi bir floresan boya testi çift sarmallı DNA'ya özgü bağlanır. Ham hazırlıklarda absorbans genellikle daha yüksek sayıdır. İkisi temiz, saflaştırılmış çift sarmallı DNA'da birbirine yakın sonuç verir.

A260'ım 1,5'in üzerinde. Yine de kullanabilir miyim?

Örneği seyreltin ve yeniden okuyun. Çoğu spektrofotometre yüksek absorbansta doğrusallığını yitirir; bu yüzden 1,5'in çok üzerindeki bir okuma gerçek konsantrasyonu olduğundan düşük gösterir. Hesaplayıcının cevabı stoka geri ölçeklemesi için seyreltme faktörünü girin.