Calcolatore della concentrazione del DNA

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Come usare il calcolatore della concentrazione del DNA

1. 1. Scegli il tipo di campione. DNA a doppio filamento (plasmidi, prodotti di PCR, DNA genomico), DNA a singolo filamento, RNA o un oligonucleotide corto. Questo imposta il fattore di conversione e, più avanti, il peso molecolare.
2. 2. Inserisci le letture. Digita A₂₆₀. Aggiungi A₂₈₀ e A₂₃₀ per ottenere i rapporti di purezza, e una lettura del fondo (A₃₂₀) se il tuo protocollo la sottrae. Imposta il cammino ottico e il fattore di diluizione se non sono 10 mm e 1.
3. 3. Facoltativo: aggiungi un volume e una lunghezza. Il volume dà la resa totale in µg; la lunghezza (bp per il DNA a doppio filamento, nt negli altri casi) aggiunge molarità e pmol.
4. 4. Leggi il risultato. La concentrazione, i giudizi sulla purezza e il procedimento completo compaiono insieme. Passa alla modalità ng ↔ pmol per convertire una quantità di DNA senza dati di assorbanza.

Come A260 diventa una concentrazione

Gli acidi nucleici assorbono la luce ultravioletta più fortemente a 260 nm. Secondo la legge di Beer–Lambert, l'assorbanza è proporzionale alla concentrazione, quindi un unico fattore di conversione trasforma una lettura in concentrazione di massa:

Il fattore ε è specifico per il tipo di acido nucleico. Le FAQ NanoDrop di Thermo Fisher riportano questi valori, in ng·cm/µL, e una nota tecnica di New England Biolabs fornisce gli stessi tre valori come µg/mL per un cammino di 10 mm:

Sono medie per una composizione tipica di basi. Gli oligonucleotidi corti variano con la loro sequenza — il coefficiente di estinzione dell'oligo fornito dal produttore è più preciso — e alcuni riferimenti riportano un valore diverso per il DNA a singolo filamento, come 37 µg/mL. Usa il campo di sostituzione se il tuo protocollo o il fornitore specifica un altro fattore.

Leggere i rapporti di purezza

Le proteine assorbono vicino a 280 nm e molti contaminanti comuni assorbono vicino a 230 nm, quindi due rapporti danno un controllo rapido di che cos'altro c'è nella provetta:

• A₂₆₀/A₂₈₀. Circa 1,8 per il DNA pulito (NEB riporta 1,85–1,88 in tampone) e circa 2,0–2,1 per l'RNA. Un valore basso indica proteine o fenolo; un valore alto in una preparazione di DNA può indicare RNA trascinato. Le soluzioni acide danno letture più basse e quelle basiche più alte, quindi controlla il pH del tampone.
• A₂₆₀/A₂₃₀. Un indicatore più sensibile, di solito 2,0–2,4 per campioni puliti. Sali di guanidina, EDTA, detergenti, fenolo e carboidrati lo abbassano. NEB avverte che questo rapporto varia più di A₂₆₀/A₂₈₀ e va letto con cautela.
• La soglia comune. Nella pratica quotidiana, entrambi i rapporti sopra 1,8 sono considerati abbastanza puliti per la maggior parte degli usi successivi.

Esempio svolto: una miniprep di plasmide

Un plasmide di 5.000 bp è eluito in 50 µL, diluito 1 su 10 e letto in una cuvetta da 10 mm: A₂₆₀ = 0,412, A₂₈₀ = 0,222, A₂₃₀ = 0,18. Sono i valori di default del calcolatore.

1. Concentrazione: 0,412 × 50 × (10 ÷ 10) × 10 = 206 ng/µL.
2. Purezza: 0,412 ÷ 0,222 = 1,86 e 0,412 ÷ 0,18 = 2,29. Entrambi rientrano comodamente nell'intervallo di campione pulito.
3. Resa: 206 ng/µL × 50 µL = 10,3 µg di DNA nella provetta.
4. Molarità: 206 × 1.000 ÷ (660 × 5.000) = 0,06242 pmol/µL = 62,42 nM, che corrisponde a 3,121 pmol nella provetta.

Convertire tra ng e pmol

Le ricette di clonaggio e di ligazione sono scritte in picomoli, ma uno spettrofotometro dà nanogrammi. La conversione richiede la lunghezza e un peso molecolare medio per coppia di basi o per nucleotide:

Il controllo classico: 1 µg di un frammento di 1.000 bp è 1,515 pmol (3,03 pmol di estremi), lo stesso valore di 1,52 pmol per µg per kilobase che indicano i fornitori. Il valore di 660 g/mol per coppia di basi è una media; alcune fonti usano 650, che cambia i pmol di circa l'1,5%. Per un peso molecolare esatto di un oligo, usa il valore del produttore. Per pianificare un rapporto inserto-vettore a partire da queste quantità, usa il Calcolatore di ligazione.

Errori comuni

• Dimenticare il fattore di diluizione. Il valore in cuvetta è quello del campione diluito; moltiplica di nuovo per ottenere la soluzione madre.
• Usare il fattore del dsDNA per un oligo o per l'RNA. La differenza è del 33–50% nel risultato.
• Leggere fuori dall'intervallo lineare. Mantieni A₂₆₀ tra circa 0,1 e 1,5; diluisci i campioni concentrati e rileggi.
• Fidarsi dell'assorbanza per tutto. Nucleotidi liberi, RNA e frammenti a singolo filamento assorbono tutti a 260 nm, quindi l'assorbanza sovrastima la quantità di DNA a doppio filamento integro in una preparazione grezza. I coloranti fluorescenti specifici per il dsDNA sono più selettivi quando conta.

Domande frequenti

Come si calcola la concentrazione del DNA da A260?

Moltiplica la lettura di A260 per il fattore di conversione — 50 ng/µL per il DNA a doppio filamento, 33 per il DNA a singolo filamento, 40 per l'RNA — e per l'eventuale fattore di diluizione. Un'A260 di 0,412 per dsDNA diluito 1 su 10 dà 0,412 × 50 × 10 = 206 ng/µL. Per un cammino diverso da 10 mm, scala per 10 diviso per il cammino in millimetri.

Qual è un buon rapporto A260/A280?

Circa 1,8 per il DNA puro e circa 2,0 per l'RNA puro. NEB riporta 1,85–1,88 per il dsDNA pulito in tampone e circa 2,1 per l'RNA. Rapporti chiaramente più bassi indicano contaminazione da proteine o fenolo; il rapporto è inoltre spostato dal pH del tampone, quindi leggilo come una guida e non come un test di superato o non superato.

Che cosa significa un rapporto A260/A230 basso?

Qualcosa di diverso dagli acidi nucleici sta assorbendo a 230 nm. I colpevoli più comuni sono i sali di guanidina dei kit a colonna, l'EDTA, i detergenti, il fenolo e i carboidrati trascinati. Rieluisci o riprecipita il campione, e assicurati che lo strumento sia stato azzerato con lo stesso tampone del campione.

Come si converte il DNA da ng a pmol?

Dividi la massa in nanogrammi per il peso molecolare, che è circa 660 g/mol per coppia di basi nel dsDNA, e moltiplica per 1.000. Per 100 ng di un plasmide da 3.000 bp: 100 × 1.000 ÷ (660 × 3.000) = 0,0505 pmol. Il convertitore qui sopra fa questo calcolo in entrambe le direzioni.

ng/µL è lo stesso di µg/mL?

Sì. Un nanogrammo per microlitro è 10⁻⁹ g per 10⁻⁶ L, cioè 10⁻³ g/L oppure 1 µg/mL. Per questo i fattori di conversione di A260 sono riportati in entrambi i modi, come 50 ng/µL o 50 µg/mL per unità di assorbanza.

Perché la lettura del mio NanoDrop è diversa da quella di un Qubit?

L'assorbanza conta qualsiasi cosa assorba a 260 nm — RNA, nucleotidi liberi e contaminanti — mentre un saggio con colorante fluorescente come il Qubit lega specificamente il DNA a doppio filamento. Nelle preparazioni grezze l'assorbanza è di solito il numero più alto. I due valori coincidono strettamente su dsDNA pulito e purificato.

La mia A260 è sopra 1,5. Posso usarla comunque?

Diluisci il campione e rileggi. La maggior parte degli spettrofotometri perde la linearità ad alta assorbanza, quindi una lettura ben sopra 1,5 sottostima la concentrazione reale. Inserisci il fattore di diluizione in modo che il calcolatore riporti il risultato alla soluzione madre.