Calculadora de contenido GC

Cómo usar la calculadora de contenido GC

1. 1. Pega la secuencia. Letras simples o FASTA; los espacios, los saltos de línea, los números y las minúsculas se ignoran, y la U se cuenta como T. Con varios registros FASTA, cada uno tiene una fila en la tabla.
2. 2. Elige la regla de ambigüedad. Por defecto, N, R, Y y otros códigos de ambigüedad se dejan fuera del cálculo. También puedes contarlos como no GC o ponderar cada código según su probabilidad de ser G o C.
3. 3. Lee los números. El GC %, la longitud, la asimetría GC, el GC en las posiciones 1, 2 y 3 del codón y la razón observada/esperada de CpG aparecen para la secuencia seleccionada.
4. 4. Dibuja un perfil. Define una ventana y un paso, y luego representa el contenido GC, la asimetría GC o la asimetría GC acumulada a lo largo de la secuencia. Descarga el gráfico como SVG o PNG.

Qué es el contenido GC

El contenido GC es la fracción de bases de una secuencia de ADN o ARN que son guanina o citosina: GC % = (G + C) ÷ (A + C + G + T) × 100. Los pares G–C tienen tres puentes de hidrógeno y los pares A–T, dos; además, las interacciones de apilamiento aportan estabilidad, de modo que el ADN rico en GC se desnaturaliza a una temperatura más alta. El contenido GC varía mucho entre genomas y a lo largo de ellos: el genoma humano promedia alrededor del 41 %, Escherichia coli K-12 cerca del 51 %, Streptomyces coelicolor alrededor del 72 % y el parásito de la malaria Plasmodium falciparum cerca del 19 %. Para los cebadores, un contenido GC de entre 40 % y 60 % aproximadamente es el objetivo habitual.

Las secuencias reales suelen contener códigos de ambigüedad IUPAC, y hay más de una forma razonable de contarlos. Las tres opciones de aquí siguen las convenciones de gc_fraction de Biopython:

Asimetría GC y razón CpG

La asimetría GC es (G − C) ÷ (G + C), calculada en ventanas. En muchos genomas bacterianos, la hebra conductora tiene más G que C, así que la asimetría es positiva a un lado del origen de replicación y negativa al otro (Lobry, 1996, Molecular Biology and Evolution). Al representar la suma acumulada de la asimetría, la asimetría acumulada, ese cambio aparece como una V o una V invertida, cuyo mínimo y máximo marcan el origen y el término de la replicación (Grigoriev, 1998, Nucleic Acids Research). El gráfico acumulado usa ventanas no solapadas del tamaño que definas.

La razón CpG observada/esperada es recuento de CpG × longitud ÷ (recuento de C × recuento de G). En vertebrados, el CpG metilado muta con facilidad a TpG, así que el CpG escasea en la mayor parte del genoma, y una razón cercana a 1 señala tramos inusuales. La definición clásica de isla CpG (Gardiner-Garden y Frommer, 1987) es un tramo de al menos 200 pb con GC por encima del 50 % y una razón de al menos 0,6; aplícala tú mismo a una ventana de 200 pb, porque los umbrales son arbitrarios.

Ejemplo desarrollado: secuencia codificante de la insulina humana

Probar un ejemplo carga la secuencia codificante de 333 bases de la insulina humana de NCBI RefSeq NM_000207.3. Contiene 57 A, 106 C, 109 G y 61 T, así que GC = 215 ÷ 333 = 64,56 %. La asimetría es (109 − 106) ÷ 215 = 0,014, casi nula. Los diez dinucleótidos CpG dan una razón de 10 × 333 ÷ (106 × 109) = 0,29.

GC3, la tercera posición del codón, es donde ocurren los cambios sinónimos que no alteran la proteína, así que sigue la composición local de bases. Un GC3 de 80 % frente a un GC2 de 44 % es una señal típica de un gen en una región rica en GC del genoma humano. Traduce la secuencia con el traductor de ADN a proteína, o diseña cebadores para ella con la calculadora de Tm de cebadores.

Preguntas frecuentes

¿Cómo se calcula el contenido GC?

Cuenta las bases G y C, divide entre el número total de bases A, C, G y T (o U) y multiplica por 100. Para ATGCGC, eso es 4 ÷ 6 = 66,7 %. La misma fracción se usa para un genoma completo o para una ventana de 50 bases que se desliza a lo largo de un gen.

¿Qué contenido GC es normal para un cebador?

Los cebadores suelen diseñarse con entre 40 % y 60 % de GC, lo que da una temperatura de fusión manejable y evita tramos largos de G o C que se unen de forma inespecífica. Un extremo 3′ que termina en una o dos bases G o C (una pinza GC) ayuda a la hibridación, pero más de tres seguidas pueden causar un cebado erróneo. Comprueba la temperatura de fusión con la calculadora de Tm de cebadores.

¿Qué indica la asimetría GC?

La asimetría GC, (G − C) ÷ (G + C), mide la asimetría entre hebras. En muchas bacterias la hebra conductora está enriquecida en G, así que el signo de la asimetría cambia en el origen y el término de la replicación. Un gráfico de asimetría acumulada hace visibles esos dos puntos de cambio como el mínimo y el máximo, una forma rápida de localizar el origen de replicación en un genoma nuevo.

¿Por qué difiere el contenido GC entre organismos?

El sesgo de mutación, la reparación del ADN, la replicación y la selección dan forma a la composición de bases, y el equilibrio difiere entre linajes. Las bacterias de vida libre van de aproximadamente 25 % a 75 % de GC, y los vertebrados de sangre caliente muestran grandes variaciones regionales llamadas isócoras. Dentro de un genoma, las regiones ricas en GC tienden a tener más genes.

¿Cómo se cuentan los códigos de ambigüedad como N?

Por defecto se dejan fuera tanto del numerador como del denominador. También puedes mantenerlos en el denominador como no GC, o ponderar cada código según la proporción de sus bases posibles que son G o C, de modo que N cuente como 0,5. Las tres opciones coinciden con los ajustes "remove", "ignore" y "weighted" de Biopython.

¿Qué tamaño de ventana debo usar para un gráfico GC?

Usa una ventana lo bastante larga para obtener estimaciones estables y lo bastante corta para mostrar la característica que te interesa. Entre 100 y 200 bases sirve para un gen o para buscar islas CpG, entre 1.000 y 10.000 para un genoma bacteriano, y el paso puede ser entre una quinta parte y la mitad de la ventana. Si el paso diera más de 2.000 ventanas, la herramienta lo sube automáticamente para que el gráfico siga siendo legible.