Calcolatore del contenuto GC

Come usare il calcolatore del contenuto GC

1. 1. Incolla la sequenza. Lettere semplici o FASTA; spazi, a capo, numeri e minuscole vengono ignorati, e la U viene contata come T. Con più record FASTA, ognuno ottiene una riga nella tabella.
2. 2. Scegli la regola per l'ambiguità. L'impostazione predefinita esclude N, R, Y e gli altri codici di ambiguità dal calcolo. In alternativa puoi contarli come non-GC oppure pesare ogni codice in base alla sua probabilità di essere G o C.
3. 3. Leggi i valori. Per la sequenza selezionata compaiono GC%, lunghezza, skew GC, GC nelle posizioni 1, 2 e 3 del codone e il rapporto osservato/atteso CpG.
4. 4. Traccia un profilo. Imposta una finestra e un passo, poi traccia il contenuto GC, lo skew GC o lo skew GC cumulativo lungo la sequenza. Scarica il grafico in SVG o PNG.

Che cos'è il contenuto GC

Il contenuto GC è la frazione di basi di una sequenza di DNA o RNA che sono guanina o citosina: GC% = (G + C) ÷ (A + C + G + T) × 100. Le coppie G–C hanno tre legami a idrogeno e le coppie A–T due, e le interazioni di impilamento aggiungono ulteriore stabilità, quindi il DNA ricco di GC fonde a una temperatura più alta. Il contenuto GC varia molto tra i genomi e lungo il genoma stesso: il genoma umano ha in media circa il 41%, Escherichia coli K-12 circa il 51%, Streptomyces coelicolor circa il 72% e il parassita della malaria Plasmodium falciparum circa il 19%. Per i primer, un contenuto GC di circa il 40–60% è l'obiettivo abituale.

Le sequenze reali contengono spesso codici di ambiguità IUPAC, e ci sono più modi ragionevoli per contarli. Le tre opzioni qui seguono le convenzioni della funzione gc_fraction di Biopython:

Skew GC e rapporto CpG

Lo skew GC è (G − C) ÷ (G + C), calcolato in finestre. In molti genomi batterici il filamento guida ha più G che C, quindi lo skew è positivo da un lato dell'origine di replicazione e negativo dall'altro (Lobry, 1996, Molecular Biology and Evolution). Tracciando la somma progressiva dello skew — lo skew cumulativo — quel cambio diventa una V o una V rovesciata il cui minimo e massimo indicano l'origine e il terminus della replicazione (Grigoriev, 1998, Nucleic Acids Research). Il grafico cumulativo usa finestre non sovrapposte della dimensione che imposti.

Il rapporto osservato/atteso CpG è conteggio CpG × lunghezza ÷ (conteggio C × conteggio G). Nei vertebrati, il CpG metilato muta facilmente in TpG, quindi il CpG è impoverito in gran parte del genoma e un rapporto vicino a 1 segnala tratti insoliti. La definizione classica di isola CpG (Gardiner-Garden e Frommer, 1987) è un tratto di almeno 200 bp con GC superiore al 50% e un rapporto di almeno 0,6; applicala tu stesso a una finestra di 200 bp, perché le soglie sono arbitrarie.

Esempio svolto: sequenza codificante dell'insulina umana

Prova un esempio carica la sequenza codificante di 333 basi dell'insulina umana dal database NCBI RefSeq NM_000207.3. Contiene 57 A, 106 C, 109 G e 61 T, quindi GC = 215 ÷ 333 = 64,56%. Lo skew è (109 − 106) ÷ 215 = 0,014, quasi nullo. I dieci dinucleotidi CpG danno un rapporto di 10 × 333 ÷ (106 × 109) = 0,29.

GC3, la terza posizione del codone, è dove avvengono i cambiamenti sinonimi senza alterare la proteina, quindi segue la composizione locale di basi. Un GC3 dell'80% contro un GC2 del 44% è un segno tipico di un gene in una regione ricca di GC del genoma umano. Traduci la sequenza con il traduttore da DNA a proteina, oppure progetta i primer per essa con il calcolatore della Tm dei primer.

Domande frequenti

Come si calcola il contenuto GC?

Conta le basi G e C, dividi per il numero totale di basi A, C, G e T (o U) e moltiplica per 100. Per ATGCGC è 4 ÷ 6 = 66,7%. La stessa frazione si usa per un intero genoma o per una finestra di 50 basi che scorre lungo un gene.

Qual è un contenuto GC normale per un primer?

I primer si progettano di solito con il 40–60% di GC, che dà una temperatura di fusione in un intervallo utilizzabile ed evita lunghe serie di G o C che si legano in modo aspecifico. Un'estremità 3′ che termina con una o due basi G o C (una clamp GC) favorisce l'appaiamento, mentre più di tre di seguito possono causare un appaiamento errato. Verifica la temperatura di fusione con il calcolatore della Tm dei primer.

Che cosa indica lo skew GC?

Lo skew GC, (G − C) ÷ (G + C), misura l'asimmetria tra i filamenti. In molti batteri il filamento guida è arricchito in G, quindi il segno dello skew si inverte all'origine e al terminus di replicazione. Un grafico dello skew cumulativo rende visibili i due punti di inversione come minimo e massimo, un modo rapido per localizzare l'origine di replicazione in un nuovo genoma.

Perché il contenuto GC differisce tra organismi?

Il bias mutazionale, la riparazione del DNA, la replicazione e la selezione modellano tutti la composizione delle basi, e l'equilibrio varia tra i lignaggi. I batteri a vita libera vanno da circa il 25% a circa il 75% di GC, e i vertebrati a sangue caldo mostrano ampie variazioni regionali chiamate isocore. All'interno di un genoma, le regioni ricche di GC tendono a essere ricche di geni.

Come vengono contati i codici di ambiguità come N?

Per impostazione predefinita sono esclusi sia dal numeratore sia dal denominatore. In alternativa puoi mantenerli nel denominatore come non-GC, oppure pesare ogni codice in base alla quota delle sue basi possibili che sono G o C, così N conta 0,5. Le tre scelte corrispondono alle impostazioni "remove", "ignore" e "weighted" di Biopython.

Che dimensione di finestra devo usare per un grafico GC?

Usa una finestra abbastanza lunga da dare stime stabili e abbastanza corta da mostrare la caratteristica che ti interessa. Intorno a 100–200 basi va bene per un gene o per la ricerca di un'isola CpG, 1.000–10.000 per un genoma batterico, e il passo può essere da un quinto alla metà della finestra. Se il passo desse più di 2.000 finestre, lo strumento lo alza automaticamente per mantenere il grafico leggibile.