Калькулятор GC-содержания

Как пользоваться калькулятором GC-содержания

1. 1. Вставьте последовательность. Простые буквы или FASTA; пробелы, переносы строк, цифры и строчные буквы пропускаются, а U считается как T. Если записей FASTA несколько, каждая получает строку в таблице.
2. 2. Выберите правило для кодов неоднозначности. По умолчанию N, R, Y и другие коды неоднозначности не учитываются в расчёте. Вместо этого можно считать их как не-GC или взвесить каждый код по вероятности того, что это G или C.
3. 3. Прочитайте результаты. Для выбранной последовательности появятся GC%, длина, GC-асимметрия, GC в позициях кодона 1, 2 и 3 и отношение наблюдаемого к ожидаемому CpG.
4. 4. Постройте профиль. Задайте окно и шаг, затем постройте график GC-содержания, GC-асимметрии или накопленной GC-асимметрии вдоль последовательности. График можно скачать в SVG или PNG.

Что такое GC-содержание

GC-содержание — это доля оснований в последовательности ДНК или РНК, которые являются гуанином или цитозином: GC% = (G + C) ÷ (A + C + G + T) × 100. Пара G–C образует три водородные связи, а пара A–T — две, и стекинг-взаимодействия добавляют стабильности, поэтому ДНК, богатая GC, плавится при более высокой температуре. GC-содержание сильно различается между геномами и внутри них: геном человека в среднем содержит около 41%, Escherichia coli K-12 — около 51%, Streptomyces coelicolor — около 72%, а у малярийного паразита Plasmodium falciparum — около 19%. Для праймеров обычно ориентируются примерно на 40–60%.

В реальных последовательностях часто встречаются коды неоднозначности IUPAC, и их можно учитывать несколькими разумными способами. Три варианта здесь следуют соглашениям функции gc_fraction из Biopython:

GC-асимметрия и отношение CpG

GC-асимметрия — это (G − C) ÷ (G + C), вычисляемая в окнах. Во многих бактериальных геномах ведущая цепь содержит больше G, чем C, поэтому асимметрия положительна с одной стороны от точки начала репликации и отрицательна с другой (Lobry, 1996, Molecular Biology and Evolution). График накопленной суммы асимметрии — накопленной асимметрии — превращает этот переход в V или перевёрнутую V, у которой минимум и максимум отмечают начало и конец репликации (Grigoriev, 1998, Nucleic Acids Research). Накопленный график использует непересекающиеся окна выбранного вами размера.

Отношение CpG наблюдаемое/ожидаемое равно число CpG × длина ÷ (число C × число G). У позвоночных метилированный CpG легко мутирует в TpG, поэтому CpG обеднён в большей части генома, и отношение около 1 отмечает необычные участки. Классическое определение островка CpG (Gardiner-Garden and Frommer, 1987) — участок длиной не менее 200 пн с GC выше 50% и отношением не ниже 0,6; применяйте его к окну в 200 пн самостоятельно, поскольку пороговые значения произвольны.

Пример: кодирующая последовательность инсулина человека

Попробовать пример загружает кодирующую последовательность инсулина человека длиной 333 нт из NCBI RefSeq NM_000207.3. В ней 57 A, 106 C, 109 G и 61 T, поэтому GC = 215 ÷ 333 = 64,56%. Асимметрия равна (109 − 106) ÷ 215 = 0,014, то есть почти нулевая. Десять динуклеотидов CpG дают отношение 10 × 333 ÷ (106 × 109) = 0,29.

GC3, третья позиция кодона, — это место, где синонимичные замены происходят без изменения белка, поэтому она отражает локальный состав оснований. GC3 в 80% при GC2 в 44% — типичный признак гена в богатом GC участке генома человека. Переведите последовательность с помощью инструмента Переводчик ДНК в белок или подберите для неё праймеры в Калькуляторе Tm праймеров.

Часто задаваемые вопросы

Как рассчитать GC-содержание?

Подсчитайте G и C, разделите на общее число оснований A, C, G и T (или U) и умножьте на 100. Для ATGCGC это 4 ÷ 6 = 66,7%. Та же доля используется для целого генома или для окна из 50 оснований, скользящего вдоль гена.

Каким должно быть GC-содержание праймера?

Праймеры обычно создают с 40–60% GC: это даёт температуру плавления в рабочем диапазоне и избегает длинных участков из G или C, которые связываются неспецифично. Конец 3′ с одним или двумя основаниями G или C (GC-клэмп) помогает отжигу, а более трёх подряд могут вызвать неспецифическое праймирование. Проверьте температуру плавления с помощью калькулятора Tm праймеров.

Что показывает GC-асимметрия?

GC-асимметрия, (G − C) ÷ (G + C), измеряет асимметрию цепей. Во многих бактериях ведущая цепь обогащена G, поэтому знак асимметрии меняется в точках начала и конца репликации. График накопленной асимметрии делает эти два переключения видимыми как минимум и максимум, что быстро помогает найти начало репликации в новом геноме.

Почему GC-содержание различается у разных организмов?

Смещение мутаций, репарация ДНК, репликация и отбор определяют состав оснований, и баланс различается между линиями. Свободноживущие бактерии имеют от примерно 25% до 75% GC, а у теплокровных позвоночных наблюдаются большие региональные вариации, которые называют изохорами. Внутри генома участки, богатые GC, как правило, плотнее заполнены генами.

Как учитываются коды неоднозначности, например N?

По умолчанию они исключаются и из числителя, и из знаменателя. Вместо этого можно оставить их в знаменателе как не-GC или взвесить каждый код по доле его возможных оснований, являющихся G или C, так что N считается как 0,5. Три варианта соответствуют настройкам Biopython "remove", "ignore" и "weighted".

Какой размер окна выбрать для графика GC?

Берите окно достаточно длинным для устойчивых оценок и достаточно коротким, чтобы показать нужную особенность. Около 100–200 пн подходит для гена или поиска островков CpG, 1 000–10 000 пн — для бактериального генома, а шаг может составлять от одной пятой до половины окна. Если шаг дал бы более 2 000 окон, инструмент автоматически увеличит его, чтобы график оставался читаемым.