Công Cụ Tính Hàm Lượng GC

Cách Sử Dụng Công Cụ Tính Hàm Lượng GC

1. 1. Dán chuỗi. Chữ cái thô hoặc FASTA; khoảng trắng, ngắt dòng, số và chữ thường đều bị bỏ qua, và U được tính như T. Với nhiều bản ghi FASTA, mỗi bản ghi có một dòng trong bảng.
2. 2. Chọn quy tắc cho mã mơ hồ. Mặc định, N, R, Y và các mã mơ hồ khác bị loại khỏi phép tính. Bạn cũng có thể tính chúng là không phải GC, hoặc gán trọng số cho mỗi mã theo xác suất là G hoặc C.
3. 3. Đọc các số liệu. GC%, độ dài, độ lệch GC, GC tại vị trí codon 1, 2 và 3, và tỷ lệ CpG quan sát/kỳ vọng xuất hiện cho chuỗi đã chọn.
4. 4. Vẽ hồ sơ. Đặt cửa sổ và bước nhảy, rồi vẽ hàm lượng GC, độ lệch GC hoặc độ lệch GC tích lũy dọc theo chuỗi. Tải biểu đồ về dạng SVG hoặc PNG.

Hàm Lượng GC Là Gì

Hàm lượng GC là tỷ lệ các base trong một chuỗi DNA hoặc RNA là guanine hoặc cytosine: GC% = (G + C) ÷ (A + C + G + T) × 100. Cặp G–C có ba liên kết hydro và cặp A–T có hai, và các tương tác xếp chồng làm tăng thêm độ bền, nên DNA giàu GC nóng chảy ở nhiệt độ cao hơn. Hàm lượng GC khác nhau nhiều giữa các bộ gen và ngay trong một bộ gen: bộ gen người trung bình khoảng 41%, Escherichia coli K-12 khoảng 51%, Streptomyces coelicolor khoảng 72% và ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum khoảng 19%. Với primer, mục tiêu thường gặp là khoảng 40–60% GC.

Chuỗi thực tế thường chứa các mã mơ hồ IUPAC, và có nhiều cách hợp lý để đếm chúng. Ba lựa chọn ở đây theo quy ước trong gc_fraction của Biopython:

Độ Lệch GC và Tỷ Lệ CpG

Độ lệch GC là (G − C) ÷ (G + C), tính theo từng cửa sổ. Ở nhiều bộ gen vi khuẩn, sợi dẫn có nhiều G hơn C, nên độ lệch dương ở một phía của điểm khởi đầu sao chép và âm ở phía kia (Lobry, 1996, Molecular Biology and Evolution). Vẽ tổng cộng dồn của độ lệch — độ lệch tích lũy — biến sự chuyển đổi đó thành hình chữ V hoặc chữ V ngược, với điểm cực tiểu và cực đại đánh dấu điểm khởi đầu và điểm kết thúc sao chép (Grigoriev, 1998, Nucleic Acids Research). Biểu đồ tích lũy dùng các cửa sổ không chồng lên nhau có kích thước bạn đã đặt.

Tỷ lệ CpG quan sát/kỳ vọng là số CpG × độ dài ÷ (số C × số G). Ở động vật có xương sống, CpG bị methyl hóa dễ đột biến thành TpG, nên CpG bị suy giảm trên hầu hết bộ gen, và tỷ lệ gần 1 đánh dấu những đoạn bất thường. Định nghĩa cổ điển của đảo CpG (Gardiner-Garden và Frommer, 1987) là một đoạn dài ít nhất 200 bp có GC trên 50% và tỷ lệ ít nhất 0,6; hãy tự áp dụng trên cửa sổ 200 bp, vì các ngưỡng này mang tính quy ước.

Ví Dụ Minh Họa: Chuỗi Mã Hóa Insulin Người

Thử một ví dụ tải chuỗi mã hóa 333 base của insulin người từ NCBI RefSeq NM_000207.3. Chuỗi có 57 A, 106 C, 109 G và 61 T, nên GC = 215 ÷ 333 = 64,56%. Độ lệch là (109 − 106) ÷ 215 = 0,014, gần như không đáng kể. Mười dinucleotide CpG cho tỷ lệ 10 × 333 ÷ (106 × 109) = 0,29.

GC3, vị trí codon thứ ba, là nơi các thay đổi đồng nghĩa xảy ra mà không làm thay đổi protein, nên nó theo sát thành phần base cục bộ. GC3 80% so với GC2 44% là dấu hiệu điển hình của một gen nằm trong vùng giàu GC của bộ gen người. Dịch chuỗi bằng Công Cụ Dịch DNA Sang Protein, hoặc thiết kế primer cho nó bằng Primer Tm Calculator.

Câu Hỏi Thường Gặp

Làm thế nào để tính hàm lượng GC?

Đếm số base G và C, chia cho tổng số base A, C, G và T (hoặc U), rồi nhân với 100. Với ATGCGC, đó là 4 ÷ 6 = 66,7%. Cùng một phân số được dùng cho cả bộ gen hay cho một cửa sổ 50 base trượt dọc theo một gen.

Hàm lượng GC bình thường cho primer là bao nhiêu?

Primer thường được thiết kế với 40–60% GC, cho nhiệt độ nóng chảy nằm trong khoảng hợp lý và tránh các chuỗi G hoặc C dài bắt cặp không đặc hiệu. Đầu 3′ kết thúc bằng một hoặc hai base G hoặc C (GC clamp) giúp bắt cặp, nhưng hơn ba base liên tiếp có thể gây bắt cặp nhầm. Hãy kiểm tra nhiệt độ nóng chảy bằng Primer Tm Calculator.

Độ lệch GC cho bạn biết điều gì?

Độ lệch GC, (G − C) ÷ (G + C), đo sự bất đối xứng giữa hai sợi. Ở nhiều vi khuẩn, sợi dẫn giàu G, nên dấu của độ lệch đổi chiều tại điểm khởi đầu và điểm kết thúc sao chép. Biểu đồ độ lệch tích lũy làm hai điểm chuyển đổi đó hiện ra thành cực tiểu và cực đại, một cách nhanh chóng để xác định điểm khởi đầu sao chép trong một bộ gen mới.

Tại sao hàm lượng GC khác nhau giữa các sinh vật?

Thiên lệch đột biến, sửa chữa DNA, sao chép và chọn lọc đều định hình thành phần base, và sự cân bằng này khác nhau giữa các dòng tiến hóa. Vi khuẩn sống tự do dao động từ khoảng 25% đến 75% GC, và các động vật có xương sống máu nóng cho thấy biến thiên lớn theo vùng gọi là isochore. Trong một bộ gen, các vùng giàu GC thường có mật độ gen cao.

Các mã mơ hồ như N được đếm như thế nào?

Mặc định, chúng bị loại khỏi cả tử số và mẫu số. Bạn cũng có thể giữ chúng trong mẫu số như không phải GC, hoặc gán trọng số cho mỗi mã theo tỷ lệ các base có thể có là G hoặc C, nên N được tính là 0,5. Ba lựa chọn này khớp với các thiết lập "remove", "ignore" và "weighted" của Biopython.

Tôi nên dùng cửa sổ bao nhiêu cho biểu đồ GC?

Dùng một cửa sổ đủ dài để có ước lượng ổn định và đủ ngắn để hiện đặc điểm bạn muốn. Khoảng 100–200 base phù hợp để tìm một gen hoặc đảo CpG, 1.000–10.000 phù hợp với bộ gen vi khuẩn, và bước nhảy có thể bằng một phần năm đến một nửa cửa sổ. Nếu bước nhảy sẽ cho hơn 2.000 cửa sổ, công cụ tự động tăng nó để biểu đồ dễ đọc.