Kalkulator zawartości GC

Jak korzystać z kalkulatora zawartości GC

1. 1. Wklej sekwencję. Zwykłe litery albo FASTA; spacje, znaki nowej linii, cyfry i małe litery są ignorowane, a U liczone jest jako T. Przy wielu rekordach FASTA każdy dostaje wiersz w tabeli.
2. 2. Wybierz regułę dla niejednoznaczności. Domyślnie kody N, R, Y i inne kody niejednoznaczności są pomijane w obliczeniach. Możesz zamiast tego liczyć je jako nie-GC albo ważyć każdy kod szansą, że jest to G lub C.
3. 3. Odczytaj wyniki. Dla wybranej sekwencji pojawiają się GC%, długość, asymetria GC, GC na pozycjach kodonu 1, 2 i 3 oraz stosunek obserwowanych do oczekiwanych CpG.
4. 4. Narysuj profil. Ustaw okno i krok, a potem wykreśl zawartość GC, asymetrię GC lub skumulowaną asymetrię GC wzdłuż sekwencji. Wykres pobierzesz jako SVG lub PNG.

Czym jest zawartość GC

Zawartość GC to udział zasad w sekwencji DNA lub RNA, które są guaniną lub cytozyną: GC% = (G + C) ÷ (A + C + G + T) × 100. Pary G–C mają trzy wiązania wodorowe, a pary A–T dwa, a oddziaływania układania (stacking) dodają stabilności, więc DNA bogate w GC topnieje w wyższej temperaturze. Zawartość GC mocno różni się między genomami i wzdłuż nich: genom człowieka ma średnio około 41%, Escherichia coli K-12 około 51%, Streptomyces coelicolor około 72%, a pasożyt malarii Plasmodium falciparum około 19%. Dla starterów typowym celem jest zawartość GC rzędu 40–60%.

Prawdziwe sekwencje często zawierają kody niejednoznaczności IUPAC, a liczyć je można na więcej niż jeden rozsądny sposób. Trzy opcje tutaj są zgodne z konwencjami z funkcji gc_fraction w Biopythonie:

Asymetria GC i stosunek CpG

Asymetria GC to (G − C) ÷ (G + C), liczona w oknach. W wielu genomach bakterii nić wiodąca ma więcej G niż C, więc asymetria jest dodatnia po jednej stronie początku replikacji, a ujemna po drugiej (Lobry, 1996, Molecular Biology and Evolution). Wykreślenie sumy bieżącej asymetrii — skumulowanej asymetrii — zamienia tę zmianę w literę V lub odwróconą literę V, której minimum i maksimum wskazują początek i terminację replikacji (Grigoriev, 1998, Nucleic Acids Research). Wykres skumulowany używa nienakładających się okien o rozmiarze, który ustawisz.

Stosunek CpG obserwowany do oczekiwanego to liczba CpG × długość ÷ (liczba C × liczba G). U kręgowców metylowane CpG łatwo mutuje do TpG, więc CpG jest zubożone w większości genomu, a stosunek bliski 1 zaznacza nietypowe odcinki. Klasyczna definicja wyspy CpG (Gardiner-Garden i Frommer, 1987) to odcinek co najmniej 200 pz o zawartości GC powyżej 50% i stosunku co najmniej 0,6; zastosuj ją sam do okna 200 pz, bo progi są arbitralne.

Przykład krok po kroku: sekwencja kodująca insuliny człowieka

Wypróbuj przykład wczytuje 333-zasadową sekwencję kodującą insuliny człowieka z NCBI RefSeq NM_000207.3. Zawiera 57 A, 106 C, 109 G i 61 T, więc GC = 215 ÷ 333 = 64,56%. Asymetria wynosi (109 − 106) ÷ 215 = 0,014, czyli prawie zero. Dziesięć dinukleotydów CpG daje stosunek 10 × 333 ÷ (106 × 109) = 0,29.

GC3, czyli trzecia pozycja kodonu, to miejsce, w którym zmiany synonimiczne nie zmieniają białka, więc odzwierciedla lokalny skład zasad. GC3 wynoszące 80% przy GC2 na poziomie 44% to typowy znak genu w regionie genomu człowieka bogatym w GC. Przetłumacz sekwencję narzędziem Tłumacz DNA na białko albo zaprojektuj do niej startery narzędziem Primer Tm Calculator.

Najczęstsze pytania

Jak oblicza się zawartość GC?

Zlicz zasady G i C, podziel przez łączną liczbę zasad A, C, G i T (lub U) i pomnóż przez 100. Dla ATGCGC wynosi to 4 ÷ 6 = 66,7%. Ten sam ułamek stosuje się do całego genomu albo do okna 50 zasad przesuwanego wzdłuż genu.

Jaka zawartość GC jest normalna dla startera?

Startery projektuje się zwykle z zawartością GC 40–60%, co daje temperaturę topnienia w użytecznym zakresie i unika długich serii G lub C, które wiążą się niespecyficznie. Koniec 3′ kończący się jedną lub dwiema zasadami G lub C (tzw. zacisk GC) pomaga w przyłączaniu, ale więcej niż trzy z rzędu mogą powodować błędne przyłączenie. Temperaturę topnienia sprawdzisz narzędziem Primer Tm Calculator.

Co mówi asymetria GC?

Asymetria GC, (G − C) ÷ (G + C), mierzy asymetrię między niciami DNA. U wielu bakterii nić wiodąca jest wzbogacona w G, więc znak asymetrii zmienia się na początku i terminacji replikacji. Wykres skumulowanej asymetrii pokazuje oba punkty przełączenia jako minimum i maksimum, co jest szybkim sposobem na znalezienie początku replikacji w nowym genomie.

Dlaczego zawartość GC różni się między organizmami?

Na skład zasad wpływają błąd mutacji, naprawa DNA, replikacja i dobór naturalny, a równowaga ta różni się między liniami ewolucyjnymi. Bakterie żyjące swobodnie mają od około 25% do 75% GC, a kręgowce stałocieplne wykazują duże zróżnicowanie regionalne zwane izochorami. W obrębie genomu regiony bogate w GC zwykle zawierają gęsto rozmieszczone geny.

Jak liczy się kody niejednoznaczności, takie jak N?

Domyślnie są pomijane zarówno w liczniku, jak i w mianowniku. Możesz też zostawić je w mianowniku jako nie-GC albo ważyć każdy kod udziałem jego możliwych zasad, które są G lub C, tak że N liczy się jako 0,5. Trzy wybory odpowiadają ustawieniom Biopythona "remove", "ignore" i "weighted".

Jaki rozmiar okna wybrać dla wykresu GC?

Użyj okna dość długiego, by oszacowania były stabilne, i dość krótkiego, by pokazać interesującą cechę. Około 100–200 zasad nadaje się do genu lub wyszukiwania wysp CpG, 1 000–10 000 do genomu bakteryjnego, a krok może wynosić od jednej piątej do połowy okna. Jeśli krok dawałby więcej niż 2 000 okien, narzędzie podnosi go automatycznie, aby wykres pozostał czytelny.