GC-gehaltecalculator

Zo gebruik je de GC-gehaltecalculator

1. 1. Plak de sequentie. Gewone letters of FASTA; spaties, regeleinden, cijfers en kleine letters worden genegeerd, en U telt als T. Bij meerdere FASTA-records krijgt elk record een rij in de tabel.
2. 2. Kies de regel voor dubbelzinnigheid. De standaardinstelling laat N, R, Y en andere dubbelzinnigheidscodes buiten de berekening. Je kunt ze ook als niet-GC tellen of elke code wegen naar de kans dat het een G of C is.
3. 3. Lees de getallen af. GC%, lengte, GC-skew, GC op codonposities 1, 2 en 3, en de CpG waargenomen/verwacht-verhouding verschijnen voor de gekozen sequentie.
4. 4. Teken een profiel. Stel een venster en een stap in en teken het GC-gehalte, de GC-skew of de cumulatieve GC-skew langs de sequentie. Download de grafiek als SVG of PNG.

Wat GC-gehalte is

Het GC-gehalte is het deel van de basen in een DNA- of RNA-sequentie dat guanine of cytosine is: GC% = (G + C) ÷ (A + C + G + T) × 100. G–C-paren hebben drie waterstofbruggen en A–T-paren er twee, en stapelinteracties voegen extra stabiliteit toe, dus DNA met veel GC smelt bij een hogere temperatuur. Het GC-gehalte verschilt sterk tussen genomen en langs een genoom: het menselijk genoom gemiddeld ongeveer 41%, Escherichia coli K-12 ongeveer 51%, Streptomyces coelicolor ongeveer 72% en de malariaparasiet Plasmodium falciparum ongeveer 19%. Voor primers is een GC-gehalte van ongeveer 40–60% de gebruikelijke richtlijn.

Echte sequenties bevatten vaak IUPAC-dubbelzinnigheidscodes, en er zijn meer redelijke manieren om die te tellen. De drie opties hier volgen de conventies in gc_fraction van Biopython:

GC-skew en de CpG-verhouding

GC-skew is (G − C) ÷ (G + C), berekend in vensters. In veel bacteriële genomen heeft de leidende streng meer G dan C, dus is de skew aan de ene kant van het replicatie-startpunt positief en aan de andere kant negatief (Lobry, 1996, Molecular Biology and Evolution). Als je de lopende som van de skew uitzet — de cumulatieve skew — krijg je een V of een omgekeerde V waarvan het minimum en maximum het startpunt en eindpunt van de replicatie markeren (Grigoriev, 1998, Nucleic Acids Research). De cumulatieve grafiek gebruikt niet-overlappende vensters van de grootte die je instelt.

De CpG waargenomen/verwacht-verhouding is CpG-aantal × lengte ÷ (aantal C × aantal G). In gewervelden wordt gemethyleerd CpG gemakkelijk omgezet in TpG, dus is CpG over het grootste deel van het genoom uitgeput, en wijst een verhouding nabij 1 op ongewone stukken. De klassieke definitie van een CpG-eiland (Gardiner-Garden en Frommer, 1987) is een stuk van minstens 200 bp met een GC-gehalte boven 50% en een verhouding van minstens 0,6; pas die zelf toe op een venster van 200 bp, want de grenswaarden zijn willekeurig.

Uitgewerkt voorbeeld: de coderingssequentie van humane insuline

Probeer een voorbeeld laadt de coderingssequentie van 333 basen van humane insuline uit NCBI RefSeq NM_000207.3. Die bevat 57 A, 106 C, 109 G en 61 T, dus GC = 215 ÷ 333 = 64,56%. De skew is (109 − 106) ÷ 215 = 0,014, vrijwel nul. De tien CpG-dinucleotiden geven een verhouding van 10 × 333 ÷ (106 × 109) = 0,29.

GC3, de derde codonpositie, is waar synonieme veranderingen optreden zonder het eiwit te veranderen, dus die volgt de lokale basensamenstelling. Een GC3 van 80% tegenover een GC2 van 44% is een typisch teken van een gen in een GC-rijke regio van het menselijk genoom. Vertaal de sequentie met de DNA-naar-eiwitvertaler, of ontwerp er primers voor met de Primer Tm Calculator.

Veelgestelde vragen

Hoe bereken je het GC-gehalte?

Tel de G- en C-basen, deel door het totale aantal A-, C-, G- en T-basen (of U), en vermenigvuldig met 100. Voor ATGCGC is dat 4 ÷ 6 = 66,7%. Dezelfde breuk wordt gebruikt voor een heel genoom of voor een venster van 50 basen dat langs een gen schuift.

Wat is een normaal GC-gehalte voor een primer?

Primers worden meestal ontworpen met 40–60% GC. Zo ligt de smeltemperatuur in een werkbaar bereik en worden lange reeksen G of C vermeden die niet-specifiek binden. Een 3′-uiteinde dat eindigt op één of twee G- of C-basen (een GC-klem) helpt bij het aanhechten, terwijl meer dan drie achter elkaar tot verkeerde priming kan leiden. Controleer de smeltemperatuur met de Primer Tm Calculator.

Wat zegt de GC-skew je?

GC-skew, (G − C) ÷ (G + C), meet de asymmetrie tussen de strengen. In veel bacteriën is de leidende streng verrijkt met G, dus wisselt het teken van de skew bij het replicatie-startpunt en -eindpunt. Een cumulatieve skew-grafiek maakt de twee wisselpunten zichtbaar als minimum en maximum, een snelle manier om het replicatie-startpunt in een nieuw genoom te vinden.

Waarom verschilt het GC-gehalte tussen organismen?

Mutatiebias, DNA-reparatie, replicatie en selectie bepalen allemaal de basensamenstelling, en de balans verschilt per afstamming. Vrijlevende bacteriën lopen uiteen van ongeveer 25% tot 75% GC, en warmbloedige gewervelden vertonen grote regionale variatie die isochoren heten. Binnen een genoom zijn GC-rijke regio's meestal rijk aan genen.

Hoe worden dubbelzinnigheidscodes zoals N geteld?

Standaard worden ze weggelaten uit zowel de teller als de noemer. Je kunt ze ook in de noemer laten staan als niet-GC, of elke code wegen naar het aandeel van zijn mogelijke basen dat G of C is, zodat N als 0,5 telt. De drie keuzes komen overeen met de instellingen “remove”, “ignore” en “weighted” van Biopython.

Welk vensterformaat moet ik voor een GC-grafiek gebruiken?

Gebruik een venster dat lang genoeg is voor stabiele schattingen en kort genoeg om het kenmerk te tonen dat je wilt. Rond 100–200 basen past bij een gen of een zoektocht naar een CpG-eiland, 1.000–10.000 bij een bacterieel genoom, en de stap kan een vijfde tot de helft van het venster zijn. Als de stap meer dan 2.000 vensters zou geven, verhoogt de tool de stap automatisch zodat de grafiek leesbaar blijft.