Calculadora de conteúdo GC

Como usar a calculadora de conteúdo GC

1. 1. Cole a sequência. Letras simples ou FASTA; espaços, quebras de linha, números e letras minúsculas são ignorados, e U é contado como T. Com vários registros FASTA, cada um ganha uma linha na tabela.
2. 2. Escolha a regra para ambiguidade. O padrão deixa de fora N, R, Y e outros códigos de ambiguidade do cálculo. Você pode, em vez disso, contá-los como não GC ou ponderar cada código pela chance de ser G ou C.
3. 3. Leia os números. GC%, comprimento, assimetria GC, GC nas posições de códon 1, 2 e 3 e a razão CpG observado/esperado aparecem para a sequência selecionada.
4. 4. Plote um perfil. Defina uma janela e um passo e plote o conteúdo GC, a assimetria GC ou a assimetria GC acumulada ao longo da sequência. Baixe o gráfico em SVG ou PNG.

O que é conteúdo GC

Conteúdo GC é a fração das bases de uma sequência de DNA ou RNA que são guanina ou citosina: GC% = (G + C) ÷ (A + C + G + T) × 100. Pares G–C têm três ligações de hidrogênio e pares A–T têm duas, e as interações de empilhamento acrescentam mais estabilidade; por isso, o DNA rico em GC derrete em uma temperatura mais alta. O conteúdo GC varia muito entre genomas e ao longo deles: o genoma humano tem em média cerca de 41%, Escherichia coli K-12 cerca de 51%, Streptomyces coelicolor cerca de 72% e o parasita da malária Plasmodium falciparum cerca de 19%. Para primers, um conteúdo GC de aproximadamente 40–60% é o alvo usual.

Sequências reais costumam conter códigos de ambiguidade IUPAC, e há mais de uma forma razoável de contá-los. As três opções aqui seguem as convenções do gc_fraction do Biopython:

Assimetria GC e razão CpG

A assimetria GC é (G − C) ÷ (G + C), calculada em janelas. Em muitos genomas bacterianos a fita líder tem mais G do que C, então a assimetria é positiva de um lado da origem da replicação e negativa do outro (Lobry, 1996, Molecular Biology and Evolution). Plotar a soma acumulada da assimetria — a assimetria acumulada — transforma essa troca em um V ou um V invertido, cujo mínimo e máximo marcam a origem e o término da replicação (Grigoriev, 1998, Nucleic Acids Research). O gráfico acumulado usa janelas não sobrepostas do tamanho que você definir.

A razão CpG observado/esperado é contagem de CpG × comprimento ÷ (contagem de C × contagem de G). Em vertebrados, o CpG metilado muta com facilidade para TpG, de modo que o CpG é escasso na maior parte do genoma, e uma razão próxima de 1 marca trechos incomuns. A definição clássica de ilha CpG (Gardiner-Garden e Frommer, 1987) é um trecho de pelo menos 200 pb com GC acima de 50% e razão de pelo menos 0,6; aplique-a você mesmo a uma janela de 200 pb, pois os limites são arbitrários.

Exemplo prático: sequência codificante da insulina humana

Experimentar um exemplo carrega a sequência codificante de 333 bases da insulina humana do NCBI RefSeq NM_000207.3. Ela contém 57 A, 106 C, 109 G e 61 T, então GC = 215 ÷ 333 = 64,56%. A assimetria é (109 − 106) ÷ 215 = 0,014, quase nenhuma. Os dez dinucleotídeos CpG dão uma razão de 10 × 333 ÷ (106 × 109) = 0,29.

GC3, a terceira posição do códon, é onde as mudanças sinônimas ocorrem sem alterar a proteína, por isso acompanha a composição local de bases. Um GC3 de 80% contra um GC2 de 44% é um sinal típico de um gene em região rica em GC do genoma humano. Traduza a sequência com o Tradutor de DNA para proteína ou desenhe primers para ela com a ferramenta Primer Tm Calculator.

Perguntas frequentes

Como se calcula o conteúdo GC?

Conte as bases G e C, divida pelo total de bases A, C, G e T (ou U) e multiplique por 100. Para ATGCGC, isso dá 4 ÷ 6 = 66,7%. A mesma fração é usada para um genoma inteiro ou para uma janela de 50 bases deslizando ao longo de um gene.

Qual é um conteúdo GC normal para um primer?

Primers costumam ser desenhados com 40–60% de GC, o que resulta em uma temperatura de melting dentro de uma faixa viável e evita longas sequências de G ou C que se ligam de forma inespecífica. Uma extremidade 3′ que termina em uma ou duas bases G ou C (um grampo GC) ajuda o anelamento, mas mais de três seguidas podem causar pareamento incorreto. Verifique a temperatura de melting com a ferramenta Primer Tm Calculator.

O que a assimetria GC indica?

A assimetria GC, (G − C) ÷ (G + C), mede a assimetria entre as fitas. Em muitas bactérias a fita líder é enriquecida em G, então o sinal da assimetria muda na origem e no término da replicação. Um gráfico de assimetria acumulada torna visíveis essas duas trocas como o mínimo e o máximo, o que é uma forma rápida de localizar a origem da replicação em um genoma novo.

Por que o conteúdo GC difere entre organismos?

Viés de mutação, reparo do DNA, replicação e seleção moldam a composição de bases, e o equilíbrio difere entre as linhagens. Bactérias de vida livre variam de cerca de 25% a 75% de GC, e vertebrados de sangue quente mostram grande variação regional, chamada de isócoros. Dentro de um genoma, regiões ricas em GC tendem a ter alta densidade de genes.

Como são contados códigos de ambiguidade como o N?

Por padrão, eles são deixados de fora tanto do numerador quanto do denominador. Você pode, em vez disso, mantê-los no denominador como não GC, ou ponderar cada código pela parcela de suas bases possíveis que são G ou C, de modo que N conta como 0,5. As três escolhas correspondem às configurações "remove", "ignore" e "weighted" do Biopython.

Que tamanho de janela devo usar em um gráfico de GC?

Use uma janela longa o bastante para estimativas estáveis e curta o bastante para mostrar o recurso que você quer. Cerca de 100–200 bases servem para um gene ou uma busca de ilha CpG, 1.000–10.000 para um genoma bacteriano, e o passo pode ser de um quinto a metade da janela. Se o passo resultasse em mais de 2.000 janelas, a ferramenta o aumenta automaticamente para que o gráfico continue legível.